{"id":100682,"date":"2010-04-05T00:00:00","date_gmt":"2010-04-05T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudio-de-la-ruta-biosintetica-del-acaricida-flavoglaucina-producido-por-eurotium-rubrum-c47-aislado-natural-de-la-cecina-de-leon\/"},"modified":"2010-04-05T00:00:00","modified_gmt":"2010-04-05T00:00:00","slug":"estudio-de-la-ruta-biosintetica-del-acaricida-flavoglaucina-producido-por-eurotium-rubrum-c47-aislado-natural-de-la-cecina-de-leon","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/analisis-microquimico\/estudio-de-la-ruta-biosintetica-del-acaricida-flavoglaucina-producido-por-eurotium-rubrum-c47-aislado-natural-de-la-cecina-de-leon\/","title":{"rendered":"Estudio de la ruta biosint\u00e9tica del acaricida flavoglaucina producido por eurotium rubrum c47, aislado natural de la cecina de le\u00f3n"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Mar\u00eda  De Los \u00e1ngeles Vidales Colinas <\/strong><\/h2>\n<p>En estudios anteriores realizados en inbiotec, se determin\u00f3 que la cepa e. Rubrum c47, aislada de la cecina, inmovilizaba y causaba la muerte de los \u00e1caros (ortiz, j. F., Tesis doctoral, 2006). Este resultado coincid\u00eda con los obtenidos en los estudios sobre la infestaci\u00f3n y m\u00e9todos de control de los \u00e1caros en el salami y el jam\u00f3n curado realizados por rota (1972) y arnau y guerrero (1995). Se comprob\u00f3 que el efecto acaricida se deb\u00eda a la flavoglaucina, compuesto identificado anteriormente en el extracto crudo de micelio de aspergillus repens (eurotium repens) (podojil y col., 1979). Dicho compuesto presentaba adem\u00e1s actividad t\u00f3xica frente a artemia salina y antibacteriana frente a bacillus subtilis (ortiz, j. F., Tesis doctoral, 2006).  con el fin de estudiar la ruta de bios\u00edntesis de flavoglaucina y desarrollar un m\u00e9todo para el control biol\u00f3gico de los \u00e1caros en el jam\u00f3n y la cecina, sin que ello afecte a las caracter\u00edsticas organol\u00e9pticas del producto final, el primer objetivo que se plante\u00f3 en este trabajo de investigaci\u00f3n fue la obtenci\u00f3n de cepas afectadas en la producci\u00f3n de flavoglaucina. Para ello la cepa e. Rubrum c47 fue sometida a un proceso de mutag\u00e9nesis con nitrosoguanidina, compuesto mediante el cual se pueden obtener un gran n\u00famero de mutantes con una tasa de mortalidad intermedia (diaz minguez y col., 1988). Posteriormente, mediante la t\u00e9cnica de cromatograf\u00eda en capa fina (tlc) se realiz\u00f3 un primer an\u00e1lisis que nos permiti\u00f3 seleccionar de forma r\u00e1pida los mutantes no-productores y superproductores de flavoglaucina.  la producci\u00f3n de flavoglaucina en ambos tipos de mutantes se determin\u00f3 posteriormente por hplc, confirm\u00e1ndose la obtenci\u00f3n de dos mutantes no-productores, a313 y t3133, y un mutante superproductor, a1161, el cual produce aproximadamente tres veces m\u00e1s flavoglaucina que la cepa parental. los mutantes no productores fueron caracterizados morfol\u00f3gica y genot\u00edpicamente debido a que presentaban diferencias fenot\u00edpicas respecto al a las descritas como propias del g\u00e9nero eurotium. La caracterizaci\u00f3n morfol\u00f3gica se llev\u00f3 a cabo en base a las caracter\u00edsticas macrosc\u00f3picas y microsc\u00f3picas del micelio en distintos medios de cultivo descritas por pitt y hocking (1997), pero no se consigui\u00f3 determinar con exactitud la especie a la que pertenec\u00edan los mutantes no-productores. La caracterizaci\u00f3n genot\u00edpica se realiz\u00f3 mediante la amplificaci\u00f3n y la secuenciaci\u00f3n de los espaciadores interg\u00e9nicos (itss) y el gen que codifica el arn ribosomal 5,8s. La variabilidad existente en estas regiones se utiliza de forma convencional como criterio de diferenciaci\u00f3n interespec\u00edfica tanto en hongos filamentosos como en levaduras (tamura y col., 2000 y boysen y col., 2000). Mediante dicha caracterizaci\u00f3n se determin\u00f3 que \u00fanicamente seis de los diez mutantes no productores analizados pertenec\u00edan a la especie e. Rubrum. De los seis mutantes seleccionados como pertenecientes a dicha especie; dos produc\u00edan flavoglaucina en peque\u00f1a cantidad, uno presentaba una gran disminuci\u00f3n en su capacidad de crecimiento y esporulaci\u00f3n y otro result\u00f3 ser un mutante inestable que volvi\u00f3 a adquirir la capacidad de producir flavoglaucina, por l que dichos mutantes fueron descartados. Finalmente se seleccionaron los mutantes a313 y t3133 como no-productores de flavoglaucina para ser utilizados en experimentos posteriores. en los an\u00e1lisis por tlc y hplc anal\u00edtico de los mutantes no-productores, a313 y t3133, se observ\u00f3 que exist\u00edan diferencias en cuanto a la naturaleza y a la cantidad de los metabolitos secundarios producidos por cada uno de ellos. Esto sugiere que estas dos cepas tienen mutaciones que afectan a genes diferentes de la ruta de bios\u00edntesis de flavoglaucina. Este hecho se confirm\u00f3 por la complementaci\u00f3n de ambas mutaciones en cepas productoras de flavoglaucina obtenidas como resultado de la fusi\u00f3n de protoplastos de a313 y t3133. Adem\u00e1s se observ\u00f3 que el mutante no-productor, a313, acumulaba dos compuestos que pensamos podr\u00edan ser posibles precursores de la flavoglaucina. Estos fueron purificados y caracterizados mediante resonancia magn\u00e9tica nuclear y espectrometr\u00eda de masas, determin\u00e1ndose que se trataba de la isodihidroauroglaucina y la auroglaucina. Ambos compuestos han sido descritos como metabolitos secundarios producidos por las especies aspergillus insuetus, a. Calidoustus y e. Amstelodami (gregory j. Slack y col., 2009). Tanto la isodihidroauroglaucina como la auroglaucina presentan una estructura molecular semejante a la de la flavoglaucina y a la aspergina, lo que implica que podr\u00edan ser intermediarios de la ruta de bios\u00edntesis de flavoglaucina. Mediante ensayos in vitro con diferentes concentraciones de ambos compuestos se determin\u00f3, sin embargo, que ninguno de ellos presenta actividad acaricida. el segundo de los objetivos de este trabajo de investigaci\u00f3n, que ten\u00eda por objeto la caracterizaci\u00f3n de los genes implicados en la ruta de bios\u00edntesis de flavoglaucina tiene inter\u00e9s desde el punto de vista biotecnol\u00f3gico porque dicha identificaci\u00f3n podr\u00eda permitir la obtenci\u00f3n de cepas superproductoras de sustancia acaricida mediante t\u00e9cnicas de mutag\u00e9nesis dirigida. Esta t\u00e9cnica nos permitir\u00eda obtener mutantes que s\u00f3lo presenten afectada la producci\u00f3n de flavoglaucina, porque mediante las t\u00e9cnicas de mutaci\u00f3n al azar se pueden producir varias mutaciones a la vez. En el caso del mutante superproductor de flavoglaucina, e. Rubrum a1161, adem\u00e1s de presentar alteraciones en la producci\u00f3n de flavoglaucina presenta una disminuci\u00f3n de su capacidad de esporulaci\u00f3n, lo que le hace ser incompatible para su aplicaci\u00f3n e implantaci\u00f3n en los jamones. como paso previo a la identificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de los genes biosint\u00e9ticos dise\u00f1amos una hipot\u00e9tica ruta de bios\u00edntesis de flavoglaucina, bas\u00e1ndonos en estudios previos sobre la s\u00edntesis de otros metabolitos secundarios con estructura policetidica y en el hecho de que los mutantes no-productores presentaban diferencias en cuanto a los metabolitos secundarios producidos. uno de estos mutantes, t3133 no produce flavoglaucina, aspergina, isodihidroglaucina y auroglaucina por lo que pensamos que pod\u00eda tener una mutaci\u00f3n en uno de los genes implicados en las etapas tempranas de la ruta biosint\u00e9tica. Puesto que autores como bingle y col., (1999) y sch\u00ed\u00bcmann y col., (2006) describen a la polic\u00e9tidosintasa como la enzima implicada en este tipo de reacciones, posiblemente este mutante tenga una mutaci\u00f3n en un gen que codifique una polic\u00e9tidosintasa. por otro lado, el mutante a313 no produce flavoglaucina, ni aspergina, pero acumula auroglaucina e isodihidroauroglaucina, los cuales, como hemos dicho anteriormente, poseen una estructura qu\u00edmica semejante a la flavoglaucina y podr\u00edan ser intermediarios de su formaci\u00f3n. Teniendo en cuenta estos datos proponemos que este mutante podr\u00eda tener una mutaci\u00f3n en uno de los genes implicado en las etapas tard\u00edas de la ruta de bios\u00edntesis de flavoglaucina. Dicha mutaci\u00f3n podr\u00eda ser en un gen que codificase una desaturasas, ya que algunos autores como sakai y kajiwara, (2003) describen enzimas de este tipo como las responsables de la reducci\u00f3n de \u00e1cidos grasos, compuestos con estructura semejante a la de los polic\u00e9tidos. una vez determinados los posibles tipos de genes implicados en la ruta de bios\u00edntesis se procedi\u00f3 a la localizaci\u00f3n y aislamiento de cada uno de ellos a partir de la biblioteca gen\u00f3mica de la cepa e. Rubrum c47 construida en el fago lambda-dash ii. Para ello, y dado que no pose\u00edamos ninguna informaci\u00f3n sobre la secuencia del genoma de e. Rubrum, se dise\u00f1aron oligonucle\u00f3tidos degenerados que permitieran amplificar fragmentos de las hipot\u00e9ticas desaturasa y polic\u00e9tidosintasa. Dicho dise\u00f1o se realiz\u00f3 teniendo en cuenta la frecuencia del uso de codones en e. Rubrum y en especies pr\u00f3ximas filogen\u00e9ticamente y las secuencias de los dominios conservados de polic\u00e9tidosintasas y desaturasas en otros hongos, tal y como describen autores como sch\u00ed\u00bcmann y hertweck, (2006); linnemannst\u00ed\u00b6ns y col, (2002); bingle y col., (1999); sakai y kajiwara, (2003); meesapyodsuk y col., (2007) y sakuradani y col., (1999).  el tercero y \u00faltimo de los objetivos de este trabajo de investigaci\u00f3n fue el desarrollo de un sistema de control biol\u00f3gico de la infestaci\u00f3n de jamones por \u00e1caros, mediante la implantaci\u00f3n de la cepa productora de flavoglaucina, e. Rubrum c47 en condiciones controladas y naturales. La cepa e. Rubrum c47, forma parte de la flora f\u00fangica que predomina en jamones y cecinas, por lo que, es una cepa que en principio puede desarrollase f\u00e1cilmente y con idoneidad bajo las condiciones medio-ambientales en las que se elaboran estos embutidos. Adem\u00e1s, al ser un microorganismo que forma parte de la flora natural del jam\u00f3n y de la cecina es previsible que su implantaci\u00f3n en dichos productos no afecte a las caracter\u00edsticas organol\u00e9pticas del producto final.  en un primer momento se pens\u00f3 en utilizar la cepa superproductora de flavoglaucina, e. Rubrum a1161, para los ensayos de implantaci\u00f3n del hongo en jamones, pero se descart\u00f3 finalmente al comprobar que ten\u00eda disminuida su capacidad de esporulaci\u00f3n, lo que era incompatible con las condiciones fijadas para conseguir una implantaci\u00f3n efectiva de la cepa en los jamones, que requerir\u00eda una elevada concentraci\u00f3n de esporas.  los resultados obtenidos en estos ensayos sugieren en primer lugar que el \u00edndice de grasa de los jamones parece influir en la implantaci\u00f3n del hongo, puesto que en aquellos m\u00e1s grasos la implantaci\u00f3n es pr\u00e1cticamente nula. La producci\u00f3n del compuesto acaricida in situ posiblemente puede verse afectada por la composici\u00f3n porcentual de grasa que presentan estos productos. Este hecho ya se hab\u00eda constatado en estudios anteriores (ortiz, j. F., Tesis doctoral, 2006), que determinaron que la producci\u00f3n de flavoglaucina y aspergina disminu\u00eda en base a la cantidad de grasa existente, debido en parte a que el crecimiento f\u00fangico es m\u00e1s lento y escaso.  por otro lado, mediante ensayos de inoculaci\u00f3n de esporas de e. Rubrum c47 en condiciones controladas de temperatura y humedad se ha conseguido implantar con \u00e9xito el hongo en jamones. Adem\u00e1s se ha observado implantaci\u00f3n de la cepa en jamones no tratados que se encontraban en el secadero natural despu\u00e9s del traslado all\u00ed de los jamones inoculados con el hongo. Sin embargo la implantaci\u00f3n no es homog\u00e9nea y parece depender, entre otros factores, del tipo de jam\u00f3n, especialmente de su porcentaje de grasa y de su tiempo de curaci\u00f3n. sin embargo se ha constatado que la implantaci\u00f3n del hongo no es capaz de proteger suficientemente a los jamones de una infestaci\u00f3n masiva de \u00e1caros, posiblemente porque los \u00e1caros se multiplican antes de que la sustancia acaricida producida por e. Rubrum tenga efecto y\/o porque la cantidad de la misma producida in situ sobre los jamones no sea suficiente para provocar una mortalidad significativa de los \u00e1caros.\t nuestros resultados permiten concluir que un control biol\u00f3gico efectivo de los \u00e1caros por e. Rubrum requerir\u00eda mejorar, por una parte, la implantaci\u00f3n del hongo en los jamones, de forma que esta sea m\u00e1s r\u00e1pida y homog\u00e9nea y sobre todo implementar la producci\u00f3n de la sustancia acaricida. Para ello ser\u00eda de ayuda tener un mayor conocimiento y control de los distintos par\u00e1metros f\u00edsicos implicados en la maduraci\u00f3n de los jamones y de los genes implicados en la bios\u00edntesis de flavoglaucina.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudio de la ruta biosint\u00e9tica del acaricida flavoglaucina producido por eurotium rubrum c47, aislado natural de la cecina de le\u00f3n<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudio de la ruta biosint\u00e9tica del acaricida flavoglaucina producido por eurotium rubrum c47, aislado natural de la cecina de le\u00f3n <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Mar\u00eda  De Los \u00e1ngeles Vidales Colinas <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Le\u00f3n<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 04\/05\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Juan  Francisco Mart\u00edn Mart\u00edn<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: germ\u00e1n Larriba calle <\/li>\n<li>federico salvador Laich (vocal)<\/li>\n<li>silvia m. Albillos Garc\u00eda (vocal)<\/li>\n<li>Mar\u00eda dolores Garc\u00eda cach\u00e1n (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Mar\u00eda De Los \u00e1ngeles Vidales Colinas En estudios anteriores realizados en inbiotec, se determin\u00f3 que la cepa [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"ast-content-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"footnotes":""},"categories":[3258,54875,4430],"tags":[204948,2980,4494,204947,191828,204949],"class_list":["post-100682","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-analisis-microquimico","category-biotecnologia-de-alimentos","category-leon","tag-federico-salvador-laich","tag-german-larriba-calle","tag-juan-francisco-martin-martin","tag-maria-de-los-angeles-vidales-colinas","tag-maria-dolores-garcia-cachan","tag-silvia-m-albillos-garcia"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/100682","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=100682"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/100682\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=100682"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=100682"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=100682"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}