{"id":100745,"date":"2010-07-05T00:00:00","date_gmt":"2010-07-05T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/caracterizacion-de-la-protea%c2%adna-no-estructural-ans-de-reovirus-aviar\/"},"modified":"2010-07-05T00:00:00","modified_gmt":"2010-07-05T00:00:00","slug":"caracterizacion-de-la-protea%c2%adna-no-estructural-ans-de-reovirus-aviar","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/santiago-de-compostela\/caracterizacion-de-la-protea%c2%adna-no-estructural-ans-de-reovirus-aviar\/","title":{"rendered":"Caracterizaci\u00f3n de la prote\u00edna no estructural \u00c2\u00bfns de reovirus aviar"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Alberto Brandariz N\u00fa\u00f1ez <\/strong><\/h2>\n<p>Los reovirus aviares pertenecen al g\u00e9nero ortoreovirus, uno de los 12 g\u00e9neros de la familia reoviridae. Estos virus carecen de envoltura lip\u00eddica y replican en el citoplasma de la c\u00e9lula hospedadora. Poseen una doble cubierta proteica de 85 nm de di\u00e1metro externo en cuyo interior se encuentra el genoma en forma de 10 segmentos de rna de doble cadena. El genoma de los reovirus aviares expresa al menos 10 prote\u00ednas estructurales y 4 no estructurales. Estudios previos pusieron de manifiesto que la prote\u00edna no estructural \u00c2\u00bfns es la \u00fanica prote\u00edna viral capaz de formar inclusiones globulares citoplasm\u00e1ticas en c\u00e9lulas transfectadas, y que es capaz de reclutar a esas estructuras a la prote\u00edna no estructural \u00c2\u00bfns y a la prote\u00edna del core \u00c2\u00bfa. Todo ello sugiere que \u00c2\u00bfns desempe\u00f1a un papel importante en los primeros estad\u00edos de la morfog\u00e9nesis viral. El an\u00e1lisis de la secuencia aminoac\u00eddica de esta prote\u00edna revel\u00f3 la existencia de dos regiones con alta probabilidad de formar estructuras coiled-coil (presentes en prote\u00ednas oligom\u00e9ricas) cerca de su extremo c-terminal.   durante esta etapa de tesis hemos analizado las propiedades de las factor\u00edas virales que forma el reovirus aviar y de las inclusiones que forma la prote\u00edna \u00c2\u00b5ns. Para ello hemos estudiado la distribuci\u00f3n intracelular de las inclusiones tanto en c\u00e9lulas transfectadas con \u00c2\u00bfns como en c\u00e9lulas infectadas con el reovirus aviar, y  hemos encontrado que las inclusiones citopl\u00e1smaticas que forma \u00c2\u00b5ns no son agresomas, no est\u00e1n asociadas al citoesqueleto y no usan los microt\u00fabulos celulares para su formaci\u00f3n y maduraci\u00f3n.           por otra parte, hemos demostrado la naturaleza homo-olig\u00f3merica  de la prote\u00edna \u00c2\u00bfns mediante ensayos de doble h\u00edbrido, lo que puso de manifiesto que los mon\u00f3meros de \u00c2\u00bfns interaccionan entre ellos. Adem\u00e1s, la purificaci\u00f3n de las inclusiones generadas por la expresi\u00f3n de muns mediante un baculovirus recombinante en c\u00e9lulas de insecto, puso de manifiesto que esas inclusiones est\u00e1n desprovistas de prote\u00ednas celulares. Para tratar de identificar la regi\u00f3n m\u00ednima de \u00c2\u00bfns que mantiene la capacidad para formar inclusiones hemos realizado delecciones de la prote\u00edna a partir de los extremos amino y carboxilo. El an\u00e1lisis de la capacidad de las versiones truncadas de \u00c2\u00bfns para formar inclusiones citoplasm\u00e1ticas, mediante microscop\u00eda de fluorescencia, revel\u00f3 que la regi\u00f3n m\u00ednima de \u00c2\u00b5ns con capacidad para formar inclusiones comprende los residuos 448-635 y contiene 4 dominios bien diferenciados: dos regiones coiled-coil, coil1 y coil 2, una  regi\u00f3n intercoil que los une, y una regi\u00f3n c-terminal que sigue al segundo coil. Posteriormente se estudi\u00f3 el papel que juegan los diferentes dominios en la formaci\u00f3n de inclusiones y llegamos a las siguientes conclusiones:   i) el coil 1 y la regi\u00f3n c-terminal son necesarios para formar inclusiones, aunque pueden ser sustituidos por un dominio de dimerizaci\u00f3n, lo que sugiere que participan en la interacci\u00f3n entre mon\u00f3meros para formar olig\u00f3meros basales.  ii) mutaciones individuales de la his-487 y de la cys-489, presentes en la regi\u00f3n intercoil, anulan la capacidad de formar inclusiones, indicando que estos residuos son imprescindibles para formar inclusiones.  iii) el dominio c-terminal juega un papel clave en la orientaci\u00f3n de los mon\u00f3meros de \u00c2\u00bfns para formar olig\u00f3meros basales, controlando as\u00ed la forma de las inclusiones y la eficiencia de su formaci\u00f3n.          tambi\u00e9n hemos identificado diferentes dominios de \u00c2\u00b5ns que son capaces de incorporarse a las inclusiones citoplasm\u00e1ticas formadas por la prote\u00edna entera. Para ello diferentes regiones de \u00c2\u00bfns fusionadas a gfp o al epitopo ha se co-transfectaron con \u00c2\u00b5ns y se analiz\u00f3 su distribuci\u00f3n intracelular por microscop\u00eda de fluorescencia. De esta manera identificamos dominios de \u00c2\u00bfns implicados en la interacci\u00f3n entre mon\u00f3meros de \u00c2\u00bfns, de los cuales el dominio intercoil es el que se incorpora con mejor eficiencia.         a continuaci\u00f3n, hemos utilizado el dominio intercoil para etiquetar prote\u00ednas ex\u00f3genas y dirigirlas a las inclusiones, lo que nos permiti\u00f3 desarrollar un sistema para detectar asociaciones entre prote\u00ednas in vivo, tanto en el citoplasma como en el n\u00facleo de c\u00e9lulas eucariotas. Adem\u00e1s, aprovechando esa misma caracter\u00edstica hemos desarrollado un m\u00e9todo para purificar prote\u00ednas asociadas a las inclusiones en c\u00e9lulas de insecto.  con estos \u00faltimos resultados, se ha presentado una  solicitud de patente basado en esta prote\u00edna para la purificaci\u00f3n de prote\u00ednas y para la detecci\u00f3n de asociaciones entre prote\u00ednas in vivo.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Caracterizaci\u00f3n de la prote\u00edna no estructural \u00c2\u00bfns de reovirus aviar<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Caracterizaci\u00f3n de la prote\u00edna no estructural \u00c2\u00bfns de reovirus aviar <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Alberto Brandariz N\u00fa\u00f1ez <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 07\/05\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Francisco Javier Benavente Mart\u00ednez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Jos\u00e9 ignacio Casal alvarez <\/li>\n<li>patricia Barral catoira (vocal)<\/li>\n<li>lorena V\u00e1zquez iglesias (vocal)<\/li>\n<li>Francisco Javier Ortego alonso (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Alberto Brandariz N\u00fa\u00f1ez Los reovirus aviares pertenecen al g\u00e9nero ortoreovirus, uno de los 12 g\u00e9neros de la 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