{"id":100995,"date":"2018-03-11T10:22:38","date_gmt":"2018-03-11T10:22:38","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/biosa%c2%adntesis-de-carotenoides-en-escherichia-coli-y-en-tejidos-no-fotosinteticos-de-arabidopsis-thaliana\/"},"modified":"2018-03-11T10:22:38","modified_gmt":"2018-03-11T10:22:38","slug":"biosa%c2%adntesis-de-carotenoides-en-escherichia-coli-y-en-tejidos-no-fotosinteticos-de-arabidopsis-thaliana","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/barcelona\/biosa%c2%adntesis-de-carotenoides-en-escherichia-coli-y-en-tejidos-no-fotosinteticos-de-arabidopsis-thaliana\/","title":{"rendered":"Bios\u00edntesis de carotenoides en escherichia coli y en tejidos no fotosint\u00e9ticos de arabidopsis thaliana"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Ant\u00eda Rodr\u00edguez Villal\u00f3n <\/strong><\/h2>\n<p>Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide presentes en todos los organismos fotosint\u00e9ticos y en algunas bacterias y hongos no fotosint\u00e9ticos. En plantas, los carotenoides se sintetizan en todo tipo de plastos y son los precursores de importantes como el \u00e1cido abc\u00edsico (aba) y las estrigolactonas. En los cloroplastos los carotenoides desempe\u00f1an un papel esencialen la fotoprtecci\u00f3n del aparato fotosint\u00e9tico mientras que en los cromoplastos se acumulan en grandes cantidades. Por el contrario, en los plastos presentes en pl\u00e1ntulas crecidas en la oscuridad (etioplastos) y en los plastos de tejidos no fotosint\u00e9ticos (leucoplastos) las cantidades que podemos encontrar de pigmentos son mucho menores.  como los restantes isoprenoides, los carotenoides se sintetizan a partir del isopentenil difosfato (ipp) y su is\u00f3mero el dimetilalil difosfato (dmapp). Estos precursores pueden ser sintetizados por dos v\u00edas diferentes: la v\u00eda del mevalonato (mva) y la v\u00eda del metileritrol 4-fosfato (mep), que se encuentra presente en eubacterias. Siendo la primera de localizaci\u00f3n citos\u00f3lica, la primera se encuentra en todos los plastos procurando los precursores necesarios para la s\u00edntesis de carotenoides. La primera reacci\u00f3n de la v\u00eda del mep es la catalizada por la deoxixilulosa 5-fosfato (dxp) sintasa (dxs) que genera dxp a partir de piruvato y gliceraldeh\u00eddo 3-fosfato. Los precursores de naturaleza isoprenoide son canalizados hacia la v\u00eda carotenog\u00e9nica por la acci\u00f3n de la fitoeno sintasa (psy), el enzima m\u00e1s importante en la regulaci\u00f3n de la v\u00eda. El fitoeno, pigmento incoloro, se convierte a continuaci\u00f3n en licopeno, reacci\u00f3n catalizada por la fitoeno desaturasa (pds) y caroteno desaturasa (zds). La ciclaci\u00f3n del licopeno produce carotenos (como \u00edY-carotneo) a partir del cual se generar\u00e1n los derivados oxigenados, las xant\u00f3filas, como la violaxantina y la lute\u00edna.  los animales no pueden sintetizar los carotenoides \u00abde novo\u00bb, pero son esenciales para la salud humana por lo que se ven obligados a obtenerlos mediante la dieta. Se ha demostrado que una dieta rica en carotenoides puede prevenir la incidencia de aparici\u00f3n de ciertos tipos de c\u00e1ncer, enfermedades coronarias o la degeneraci\u00f3n macular. Adem\u00e1s de sus propiedades antioxidantes y su uso como nutrac\u00e9uticos, los carotenoides tienen un gran valor industrial debido a su uso como colorantes naturales y por sus propiedades arom\u00e1ticas. Diversas aproximaciones biotecnol\u00f3gicas han intentado incrementar los niveles de carotenoides en microorganismos y plantas. No obstante, para la producci\u00f3n biotecnol\u00f3gica de carotenoides pueda darse a gran escala, diversos factores limitantes deber\u00e1n resolverse primero: i) determinar aquellos pasos limitantes en la bios\u00edntesis de precursores, ii) la abundancia y disponibilidad de precursores en la bios\u00edntesis de carotenoides; iii) la capacidad de almacenamiento de estos pigmentos. Adem\u00e1s el conocimiento actual sobre la regulaci\u00f3n de la bios\u00edntesis de carotenoides ha sido realizado principalmente en cloroplastos y cromoplastos donde la luz juega un papel fundamental en la modulaci\u00f3n de la actividad de los principales enzimas, sin embargo se desconoce que ocurre en los plastos de tejidos no fotosint\u00e9ticos.  objetivos el principal objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar la regulaci\u00f3n de la carotenog\u00e9nesis en bacterias en  los tejidos no fotosint\u00e9ticos de arabidopsis thaliana.  con este objetivo se llevaron a cabo dos estrategias: 1.1 mejorar la disponibilidad de precursores mediante la modificaci\u00f3n gen\u00e9tica de las principales v\u00edas de s\u00edntesis de precursores isoprenoides. aunque e. Coli puede ser modificada gen\u00e9ticamente para la producci\u00f3n de carotenoides,  tan s\u00f3lo dispone de peque\u00f1as cantidades de precursores para la s\u00edntesis de estos pigmentos. Para determinar la influencia de la disponibilidad de ipp y dmapp en la producci\u00f3n de licopeno, nuestra primera estrategia fue sobreexpresar los genes de la v\u00eda del mep end\u00f3gena de e. Coli. De forma consistente con numerosos estudios que hab\u00edan sido realizados previamente, \u00fanicamente la sobreexpresi\u00f3n del gen codificante para la dxs, y aunque de forma menor pero significativa dxr y uno de los \u00faltimos enzimas de la v\u00eda del mep, la hidroximetil butenil reductasa (hdr), provocaban aumentos en la producci\u00f3n de licopeno en comparaci\u00f3n con las c\u00e9lulas control (c\u00e9lulas transformadas con el vector vac\u00edo). Una estrategia alternativa fue incrementar los niveles de ipp y dmapp mediante la introducci\u00f3n de una v\u00eda heter\u00f3loga, la v\u00eda del mva. El oper\u00f3n del mva presenta todos los genes necesarios para la conversi\u00f3n de mva  en ipp y dmapp. Cantidades crecientes de mva ex\u00f3geno a\u00f1adido al medio se correlacionaban linealmente con cantidades crecientes de licopeno.  Dado que el fondo gen\u00e9tico de e. Coli puede influir sustancialmente en su capacidad de producir licopeno,  estudiamos la producci\u00f3n de licopeno en diferentes cepas. Inesperadamente, la producci\u00f3n de licopeno se duplicaba en una cepa alternativa, lo cual suger\u00eda que adem\u00e1s del aporte de precursores, otros factores como la capacidad de almacenamiento deben de considerarse. No obstante, este trabajo demuestra que la disponibilidad de ipp y dmapp es un importante factor limitante en la producci\u00f3n de licopeno.   2.1 analizar los mecanismos moleculares que regulan la carotenog\u00e9nesis, la s\u00edntesis de precursores y el papel de los carotenoides en etioplastos de pl\u00e1ntulas de arabidopsis thaliana crecidas en la oscuridad. en arabidopsis thaliana, la bios\u00edntesis de carotenoides est\u00e1 fuertemente activada cuando las pl\u00e1ntulas pasan de germinar en la oscuridad (escotomorfog\u00e9nesis) a un metabolismo con luz (fotomorfog\u00e9nesis). Adem\u00e1s de cambios morfol\u00f3gicos en la planta, la fotomorfog\u00e9neis provoca la transformaci\u00f3n de los etioplastos en cloroplastos. Los carotenoides presentes en los etioplastos (lute\u00edna y violaxantina como componentes mayoritarios), se encuentran asociados al cuerpo prolamelar (plb) y se cree que est\u00e1n involucrados en facilitar el ac\u00famulo de clorofilas despu\u00e9s de la iluminaci\u00f3n.  No obstante, nosotros descubrimos que la carotenog\u00e9nesis se induce cuando la fotomorfog\u00e9nesis se activa incluso en ausencia de luz. Este incremento en la tasa biosint\u00e9tica en las condiciones que acabamos de citar se correlaciona con un aumento en la actividad de la fitoeno sitnasa (psy).  El aumento en su actividad es debido a un aumento en los niveles de tr\u00e1nscritos del gen psy. L\u00edneas transg\u00e9nicas de arabidopsis que presentaban el gen reportero gus-gfp bajo el control del promotor del gen psy, mostraron que la mayor expresi\u00f3n g\u00e9nica se encontraba en los cotiledones (lugar donde se encuentran los mayores niveles de carotenoides en pl\u00e1ntulas etioladas). Adem\u00e1s vimos que \u00fanicamente induciendo la expresi\u00f3n del gen bacteriano fitoeno sintasa (crtb), observamos que se produc\u00eda un aumento en los niveles de carotenoides, lo cual no ocurr\u00eda en pl\u00e1ntulas crecidas en luz. Un aumento en la producci\u00f3n de carotenoides parec\u00eda implicar un aumento en los niveles de precursores. Sin embargo cuando analizamos los niveles de tr\u00e1nscritos de los genes de la v\u00eda mep vimos que permanec\u00edan inaleterados con la desrepresi\u00f3n de la fotomorfog\u00e9nesis. No obstante, se produc\u00eda un ac\u00famulo proteico de los principales enzimas de la v\u00eda del mep, dxs y dxr. A diferencia de lo que ocurre en luz, la sobreexpresi\u00f3n de dxs en pl\u00e1ntulas crecidas en la oscuridad no provoca un aumento en la acumulaci\u00f3n de carotenoides. Este hecho sugiere que la actividad del gen psy  m\u00e1s que la disponibilidad de precursores, es suficiente para aumentar la s\u00edntesis de estos compuestos. Sorprendentemente, vimos que al inducir \u00fanicamente  la actividad psy en nuestras l\u00edneas transg\u00e9nicas para el gen crtb, se produc\u00eda una acumulaci\u00f3n post-transcripcional de la prote\u00edna dxs. Estos resultados sugieren que psy es el enzima clave en el control de la bios\u00edntesis de carotenoides en etioplastos durante la desrepresi\u00f3n de la fotomorfog\u00e9nesis. Se deduce tambi\u00e9n que la actividad de psy de alg\u00fan modo ejerce un control en los precursores derivados de la v\u00eda mep mediante un incremento en los niveles proteicos de dxs por un mecanismo post-transcripcional que por el momento desconocemos. Estos datos sugieren que la inducci\u00f3n de la bios\u00edntesis de carotenoides en etioplastos como resultado de una activaci\u00f3n del gen psy debe tratarse de un mecanismo que facilite la adaptaci\u00f3n  al metabolismo fotosint\u00e9tico por parte de las plantas.  2.2 analizar la distribuci\u00f3n espacial de la bios\u00edntesis de carotenoides en leucoplastos de ra\u00edces y flores adem\u00e1s de su posible funci\u00f3n como precursores de hormonas como aba o estrigolactonas para optimizar la producci\u00f3n biotecnol\u00f3gica de carotenoides en plantas modificadas se requiere el conocimiento de dos aspectos fundamentales: la distribuci\u00f3n espacial de los carotenoides y de los enzimas principales que modulan la actividad de sus enzimas biosint\u00e9ticos. Aunque ambos aspectos se conocen en cloro y cromoplastos, poco se sabe acerca de lo que ocurre en los plastos de los tejidos no fotosint\u00e9ticos. con objeto de descubrir la distribuci\u00f3n de los carotenoides en los \u00f3rganos y tejidos de arabidopsis thaliana,  se realiz\u00f3 un an\u00e1lisis espacial de carotenoides empleando la microespectroscop\u00eda raman y la cromatograf\u00eda l\u00edquida de alta presi\u00f3n (hplc). Ambas t\u00e9cnicas complementarias demostraron que los carotenoides se acumulaban mayoritariamente en tejido fotosint\u00e9tico, especialmente en hojas j\u00f3venes y cotiledones, posiblemente debido al papel fotoprotecto de estos pigmentos. No obstante, pese a los bajos niveles de carotenoides detectados en ra\u00edces y flores,  un an\u00e1lisis de los tr\u00e1nscritos de psy demostr\u00f3 la expresi\u00f3n de este gen en ra\u00edces aunque a niveles inferiores que en los tejidos fotosint\u00e9ticos.  L\u00edneas transg\u00e9nicas que presentaban el gen reportero gus-gfp bajo el control del promotor del gen psy nos permitieron llevar a cabo un profundo an\u00e1lisis del patr\u00f3n de expresi\u00f3n de psy. Sorprendentemente, la expresi\u00f3n del gen reportero se localizaba en los haces vasculares de p\u00e9talos y ra\u00edces, y presentaba sus m\u00e1ximos niveles de expresi\u00f3n en tejidos fotosint\u00e9tico, especialmente en los estomas de las hojas y en las hojas j\u00f3venes. Para entender el por qu\u00e9 de la expresi\u00f3n de psy en los haces vasculares de tejidos no fotosint\u00e9ticos, se llevaron a cabo an\u00e1lisis de hibridaci\u00f3n in situ de flores y ra\u00edces estos experimentos se complementaron con an\u00e1lisis por microscop\u00eda confocal y tinci\u00f3n histoqu\u00edmica gus de secciones ortogonales de ra\u00edz. Centr\u00e1ndonos en el patr\u00f3n de expresi\u00f3n de la ra\u00edz, descubrimos que la expresi\u00f3n de gfp y de gus se localizaba en las c\u00e9ulas del floema, lo cual suger\u00eda que la s\u00edntesis de carotenoides en haces vasculares radiculares podr\u00eda estar respondiendo a la necesidad de precursores para la s\u00edntesis de aba. Esta hip\u00f3tesis se ver\u00eda reforzada por publicaciones recientes donde una isoforma  tejido espec\u00edfica de psy en ra\u00edz existe en ma\u00edz y arroz  y se induce en presencia de estres mediado por aba. Adem\u00e1s de su papel como precursores de aba, los carotenoides han sido descritos recientemente como precursores de estrigoalctonas, implicados en diversos procesos de se\u00f1alizaci\u00f3n o regulaci\u00f3n de la arquitectura de la planta. Para investigar un poco m\u00e1s sobre la posible funci\u00f3n que podr\u00edan tener los carotenoides en los haces vasculares de la ra\u00edz y su posible implicaci\u00f3n en la s\u00edntesis de hormonas como aba y estrigolactonas, decidimos bloquear la s\u00edntesis de carotenoides \u00fanicamente en el tejidos radicular. La adici\u00f3n al medio de norfluraz\u00f3n (nfz) un inhibidor de la actividad de la fitoeno desaturasa (pds), inhibe completamente la producci\u00f3n de carotenoides. No obstante, la actividad de una fitoeno sintasa bacteriana (crti) aparentemente no se ve afectada por este inhibidor qu\u00edmico. Aprovechando este hecho, generamos l\u00edneas transg\u00e9nicas para este transg\u00e9n bacteriano, crti bajo el control de dos promotores diferentes de expresi\u00f3n \u00fanicamente a\u00e9rea. En las plantas pa\u00e9reo: :crti la bios\u00edntesis de carotenoides se produc\u00eda \u00fanicamente en tejidos a\u00e9reos mientras que la carotenog\u00e9nesis radicular se ve\u00eda bloqueada \u00fanicamente en presencia de nfz. De este modo al crecer las plantas con este inhibidor qu\u00edmico podr\u00edamos determinar el papel que desempe\u00f1ar\u00edan los carotenoides en la arquitectura de la planta provocando alteraciones en el fenotipo y aclarando su posible implicaci\u00f3n en la s\u00edntesis radicular de aba. Datos preliminares hasta el momento han demostrado que la expresi\u00f3n del transg\u00e9n se encuentra mayoritariamente restringida al tejido a\u00e9reo. Estudios posteriores confirmar\u00e1n los datos obtenidos hasta el momento donde se observa que las l\u00edneas transg\u00e9nicas presentan un fenotipo similar a los mutante aba1-1 cuando son crecidas en presencia de nfz y bajo condiciones de estr\u00e9s salino. Adem\u00e1s alteraciones en la longitud de la ra\u00edz igual que la presencia de un ligero fenotipo de branching podr\u00edan apuntar hacia la implicaci\u00f3n de los carotenoides radiculares en la bios\u00edntesis de aba y estrigolactonas. No obstante, se requiere un estudio mucho m\u00e1s profundo para poder confirmar todos estos datos.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Bios\u00edntesis de carotenoides en escherichia coli y en tejidos no fotosint\u00e9ticos de arabidopsis thaliana<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Bios\u00edntesis de carotenoides en escherichia coli y en tejidos no fotosint\u00e9ticos de arabidopsis thaliana <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Ant\u00eda Rodr\u00edguez Villal\u00f3n <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 20\/05\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Manuel Rodriguez Concepcion<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: albert Boronat margosa <\/li>\n<li>Mar\u00eda  Jes\u00fas Rodrigo  esteve (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Ant\u00eda Rodr\u00edguez Villal\u00f3n Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide presentes en todos los organismos fotosint\u00e9ticos y 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