{"id":101540,"date":"2010-11-06T00:00:00","date_gmt":"2010-11-06T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/alteraciones-del-adn-de-espermatozoides-de-trucha-arco-iris-oncorhynchus-mykiss-producidas-durante-la-conservacion-seminal-consecuencias-para-la-elaboracion-de-bancos-de-germoplasma\/"},"modified":"2010-11-06T00:00:00","modified_gmt":"2010-11-06T00:00:00","slug":"alteraciones-del-adn-de-espermatozoides-de-trucha-arco-iris-oncorhynchus-mykiss-producidas-durante-la-conservacion-seminal-consecuencias-para-la-elaboracion-de-bancos-de-germoplasma","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/biologia-celular\/alteraciones-del-adn-de-espermatozoides-de-trucha-arco-iris-oncorhynchus-mykiss-producidas-durante-la-conservacion-seminal-consecuencias-para-la-elaboracion-de-bancos-de-germoplasma\/","title":{"rendered":"Alteraciones del adn de espermatozoides de trucha arco-iris (oncorhynchus mykiss) producidas durante la conservaci\u00f3n seminal: consecuencias para la elaboraci\u00f3n de bancos de germoplasma"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Seraf\u00edn P\u00e9rez Cerezales <\/strong><\/h2>\n<p>La elaboraci\u00f3n de bancos de recursos gen\u00e9ticos ha surgido como respuesta a diversas necesidades sociales y econ\u00f3micas de distinta \u00edndole. En la actualidad la conservaci\u00f3n de gametos y embriones est\u00e1 cobrando un enorme inter\u00e9s tanto desde el punto de vista de la conservaci\u00f3n de especies en peligro de extinci\u00f3n, como en la preservaci\u00f3n de genotipos de inter\u00e9s comercial o biotecnol\u00f3gico obtenidos mediante selecci\u00f3n gen\u00e9tica. En algunas especies de peces ya se est\u00e1n elaborando bancos de recursos gen\u00e9ticos con dichos fines y en otras se prev\u00e9 su potencial aplicaci\u00f3n (como es el caso de la trucha arco-iris a nivel de las piscifactor\u00edas con fines comerciales y de reintroducci\u00f3n para la pesca deportiva), pero al contrario de otros grupos de vertebrados (como los mam\u00edferos) la imposibilidad de congelar oocitos y embriones hace que la \u00fanica posibilidad de preservar los recursos gen\u00e9ticos de una especie o poblaci\u00f3n sea a trav\u00e9s de la criopreservaci\u00f3n seminal. este procedimiento ha de asegurar la conservaci\u00f3n de manera indefinida de la funcionalidad de las c\u00e9lulas esperm\u00e1ticas, garantizando que tras la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n mantienen su capacidad de fecundar y que el material gen\u00e9tico que portan es capaz de soportar correctamente el desarrollo embrionario, preservando la informaci\u00f3n gen\u00e9tica original. durante la congelaci\u00f3n seminal se producen numerosos agentes nocivos que da\u00f1an distintas estructuras, afectando a diferentes funciones celulares. Estas alteraciones reducen la eficiencia en la fecundaci\u00f3n y comprometen el correcto desarrollo de los nuevos individuos, de tal manera que se pone en peligro la transmisi\u00f3n gen\u00e9tica a la siguiente generaci\u00f3n. La formaci\u00f3n de cristales de hielo que da\u00f1an las membranas celulares, y de especies reactivas de ox\u00edgeno (ros) que modifican la naturaleza qu\u00edmica de numerosos componentes celulares, son los principales agentes lesivos descritos hasta el momento. Por ello en la optimizaci\u00f3n de los protocolos de congelaci\u00f3n seminal se trata de disminuir los efectos de dichos agentes mediante la optimizaci\u00f3n de las rampas de temperatura para la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n y el dise\u00f1o de diluyentes que contengan agentes crioprotectores (metanol, dmso, glicerol, etc.), Estabilizadores de membrana (yema de huevo, bsa, prote\u00ednas de soja, etc.) Y antioxidantes (\u00e1cido c\u00edtrico, glutati\u00f3n, melatonina, etc.).  entre las m\u00faltiples estructuras y mol\u00e9culas que se ven afectadas, el adn parece especialmente susceptible al da\u00f1o durante la criopreservaci\u00f3n. Diversos trabajos han descrito que durante la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n seminal se produce rotura de las cadenas, as\u00ed como cambios en la interacci\u00f3n entre el adn y las protaminas. A pesar de este conocimiento no est\u00e1 todav\u00eda claro si un espermatozoide portador de estos da\u00f1os es capaz de fecundar un oocito de forma natural, o si bien dichas modificaciones del material gen\u00e9tico van asociadas a otras lesiones celulares m\u00e1s acusadas que impiden su uni\u00f3n con el gameto femenino. Pero si esto ocurre, la transmisi\u00f3n de la informaci\u00f3n gen\u00e9tica que se trata de preservar, as\u00ed como la salud de la descendencia, se pueden ver comprometidas. Algunas de las consecuencias de que el adn da\u00f1ado del espermatozoide configure el genotipo de un nuevo individuo se han observado en mam\u00edferos cuando se fuerza la fecundaci\u00f3n, generando abortos durante el desarrollo y otros efectos subletales en la descendencia adulta (como por ejemplo un aumento de riesgo de padecer c\u00e1ncer). Sin duda esta problem\u00e1tica puede tener dram\u00e1ticas consecuencias cuando se aplican t\u00e9cnicas de reproducci\u00f3n asistida en humanos, pudi\u00e9ndo magnificarse cuando se combinan con la utilizaci\u00f3n de semen criopreservado. Estas t\u00e9cnicas saltan la selecci\u00f3n que ocurre en el tracto genital femenino para eliminar espermatozoides defectuosos e incrementan el riesgo de introducir material gen\u00e9tico lesionado para configurar un nuevo individuo. De hecho recientes investigaciones epidemiol\u00f3gicas relacionan la aplicaci\u00f3n de estas tecnolog\u00edas con un incremento en la incidencia de enfermedades poco frecuentes.  por lo tanto se pone de manifiesto la necesidad de caracterizar la naturaleza de las modificaciones que sufre el material gen\u00e9tico e identificar y reducir el efecto de los agentes que da\u00f1an el adn durante la criopreservaci\u00f3n seminal. Por otra parte es necesario determinar la capacidad de un espermatozoide da\u00f1ado durante la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n de fecundar el oocito y, si esto ocurre, las implicaciones que tiene para la siguiente generaci\u00f3n.  la trucha arco-iris (onchorhynchus mykiss) es una de las especies pisc\u00edcolas m\u00e1s importantes con fines alimenticios o de reintroducci\u00f3n para la pesca deportiva. La alta competitividad de las empresas ha generado la necesidad de llevar a cabo programas de mejora gen\u00e9tica, lo que puede implicar la necesidad de elaborar bancos de germoplasma. Por otra parte se ha producido ya la especializaci\u00f3n de la industria, en la cual existen unas explotaciones dedicadas solo a engorde y otras a reproducci\u00f3n. Estas \u00faltimas pueden beneficiarse del desarrollo de t\u00e9cnicas de conservaci\u00f3n seminal para mejorar los procesos productivos. Adem\u00e1s es necesario substituir los antiguos m\u00e9todos de conservaci\u00f3n seminal que se utilizan en dichas explotaciones (conservaci\u00f3n unos pocos d\u00edas a 4 \u00c2\u00bac) por un m\u00e9todo de conservaci\u00f3n indefinido.  En este sentido asegurar que el adn se mantiene intacto tras la congelaci\u00f3n permite certificar que tras dicho proceso se mantendr\u00e1 todo el potencial gen\u00e9tico que se trata de preservar.  otro interesante aspecto es el hecho de que esta especie presenta fecundaci\u00f3n externa, que implica una serie de ventajas con respecto a los mam\u00edferos que podr\u00edan convertirla en un buen modelo para el estudio de los efectos de la fecundaci\u00f3n con semen con el material gen\u00e9tico da\u00f1ado. Dichas ventajas pueden resumirse en: la existencia una menor selecci\u00f3n esperm\u00e1tica a la hora de llevar a cabo la fecundaci\u00f3n (siendo menos rigurosa y permitiendo f\u00e1cilmente la fecundaci\u00f3n con semen da\u00f1ado), la capacidad de obtener una gran cantidad de embriones a partir de un \u00fanico cruce, el f\u00e1cil manejo de los progenitores as\u00ed como la posibilidad de observaci\u00f3n y manipulaci\u00f3n de los embriones resultantes debido a su desarrollo externo.    en un primer trabajo (cap\u00edtulo uno) se comprob\u00f3 que durante la conservaci\u00f3n seminal a 4 \u00c2\u00bac durante 5 d\u00edas se produjo un grado de fragmentaci\u00f3n del adn similar al observado tras la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n siguiendo el protocolo de congelaci\u00f3n com\u00fanmente utilizado para esta especie. No obstante la criopreservaci\u00f3n conserv\u00f3 mejor la integridad de la membrana plasm\u00e1tica y posiblemente su capacidad fecundante. Por otra parte en este cap\u00edtulo se puso a punto una t\u00e9cnica para la detecci\u00f3n de bases oxidadas en puntos no fragmentados de la hebra de adn, lo que permiti\u00f3 comprobar la oxidaci\u00f3n de guaninas durante la refrigeraci\u00f3n probablemente debida a la existencia de un alto grado de estr\u00e9s oxidativo y envejecimiento celular durante el tiempo de almacenamiento, que no ocurre durante la criopreservaci\u00f3n. Cierto grado de oxidaci\u00f3n de bases tambi\u00e9n puede ocurrir en el semen congelado, pero es posible que todas las bases oxidadas durante la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n se transformen directamente en roturas de las hebras, lo que enmascarar\u00eda su presencia por su interferencia con el m\u00e9todo de detecci\u00f3n utilizado. Este trabajo demostr\u00f3 por tanto que la refrigeraci\u00f3n causa, en un periodo de 5 d\u00edas, mayor da\u00f1o oxidativo que la congelaci\u00f3n seminal,  en un segundo trabajo (cap\u00edtulo dos) se trat\u00f3 de mejorar el protocolo de congelaci\u00f3n seminal para trucha arco-iris y evaluar su eficacia con muestras de distinta calidad, para lo cual se tomaron muestras en tres momentos del periodo reproductivo. Para ello se substituy\u00f3, en la soluci\u00f3n de congelaci\u00f3n, la yema de huevo (componente original) por su fracci\u00f3n rica en lipoproteinas de baja densidad (ldl) como estabilizador de membrana. Dicha substituci\u00f3n se tradujo en una significativa reducci\u00f3n de los da\u00f1os en el material gen\u00e9tico tras la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n, as\u00ed como en una mejora de la preservaci\u00f3n de la integridad de la membrana plasm\u00e1tica incluso en momentos sub\u00f3ptimos para la congelaci\u00f3n. Por otra parte tambi\u00e9n se comprob\u00f3 que durante la \u00e9poca reproductiva existen diferencias en la calidad seminal que se ponen de manifiesto como cambios en el grado de fragmentaci\u00f3n del adn antes de que otras estructuras habitualmente analizadas se vean afectadas. Este hecho, unido a la observaci\u00f3n de que la resistencia a la congelaci\u00f3n present\u00f3 una relaci\u00f3n directa con el grado de fragmentaci\u00f3n del adn en la muestra sin congelar, ha puesto de manifiesto la importancia de evaluar dicho par\u00e1metro como predictivo de la calidad seminal antes de la criopreservaci\u00f3n. una vez conseguida una mejora en el protocolo de congelaci\u00f3n, el siguiente paso fue estudiar la producci\u00f3n de ros durante la congelaci\u00f3n-descongelaci\u00f3n utilizando ambos estabilizadores de membrana (yema de huevo y ldl) (cap\u00edtulo 3) as\u00ed como determinar de qu\u00e9 manera este estr\u00e9s afecta a la composici\u00f3n qu\u00edmica del adn en t\u00e9rminos de oxidaci\u00f3n de guaninas y citosinas. Los resultados obtenidos demuestran que la formaci\u00f3n de ros intracelular se produce en las mismas cantidades, generando los mismos niveles de ambas bases oxidadas cuando se utilizan ambos componentes. Sin embargo la fragmentaci\u00f3n de la cromatina es menor con el uso de ldl. El efecto beneficioso de este agente se debe fundamentalmente a su asociaci\u00f3n con la membrana plasm\u00e1tica, que proporciona una mayor estabilidad de la misma. Se sugiere en este cap\u00edtulo que la protecci\u00f3n aportada por el ldl frente a la fragmentaci\u00f3n del adn indicar\u00eda que una parte de la misma es debida a otros factores no relacionados con la producci\u00f3n de ros. Entre ellos se indican da\u00f1os mec\u00e1nicos producidos por la entrada de cristales de hielo en el citoplasma, que tras romper las membranas alcanzar\u00edan el interior del n\u00facleo, o los grandes cambios de volumen y forma celular y nuclear que ocurren durante los intercambios de agua y crioprotectores. en este cap\u00edtulo se han utilizado ambos tipos de muestras congeladas con el fin de fecundar oocitos con diferentes grados de fragmentaci\u00f3n del adn y comprobar su efecto en la supervivencia embrionaria. Se detect\u00f3 que las muestras congeladas con yema de huevo no presentaban espermatozoides sin da\u00f1o en el adn (todas las c\u00e9lulas presentaron al menos un 10% de fragmentaci\u00f3n), observ\u00e1ndose que mantuvieron su capacidad de fecundar. Por lo tanto los embriones resultantes de dicho esperma congelado contuvieron todos un pron\u00facleo masculino con al menos un 10% de fragmentaci\u00f3n. La fecundaci\u00f3n con estas muestras desencaden\u00f3 un dram\u00e1tico aumento de los abortos durante el desarrollo embrionario, sugiriendo que se produjo una fecundaci\u00f3n con espermatozoides conteniendo un alto grado de da\u00f1o en el adn que el oocito fue incapaz de reparar. Por otro lado, parte de los embriones obtenidos con semen criopreservado con los dos estabilizadores de membrana se incubaron con un inhibidor de la v\u00eda de reparaci\u00f3n de bases por escisi\u00f3n (ber) del oocito durante la primera segmentaci\u00f3n. Esta inhibici\u00f3n produjo un incremento de la tasa de abortos, demostrando que existen espermatozoides fecundantes que portan lesiones en el adn hasta un grado asumible por el oocito, pero que necesitan ser reparados mediante esta v\u00eda. Los resultados obtenidos en este trabajo validan la utilidad de este sistema como modelo para llevar a cabo de manera sencilla este tipo de estudios.  el \u00e9xito reproductivo del uso de semen criopreservado, en t\u00e9rminos del porcentaje de embriones que llegan a la eclosi\u00f3n, se ve pues directamente relacionado con la calidad del material gen\u00e9tico de las muestras. Sin embargo el principal problema a abordar quiz\u00e1 sea determinar si existen da\u00f1os subletales que de alg\u00fan modo ejerzan un efecto nocivo sobre el desarrollo en etapas posteriores de las larvas obtenidas. Para tratar de poner de manifiesto este tipo de modificaciones, en el capitulo cuatro se analiz\u00f3 la transcripci\u00f3n, durante el desarrollo embrionario (en embriones vivos) y tras la eclosi\u00f3n, de 8 importantes genes implicados en multitud de funciones de car\u00e1cter general en el organismo, tanto durante el desarrollo como en la vida adulta, relacionados con metabolismo, crecimiento y diferenciaci\u00f3n celular. Los embriones analizados fueron resultantes de la fecundaci\u00f3n con semen congelado con los dos componentes anteriormente citados. Los resultados revelaron que ambas muestras seminales provocaron la sobre-expresi\u00f3n de algunos genes en diferentes momentos del desarrollo. Adem\u00e1s se encontr\u00f3 una relaci\u00f3n directa entre el n\u00famero de genes afectados y el grado de fragmentaci\u00f3n del adn de la muestra utilizada, hecho que afect\u00f3 principalmente a  la transcripci\u00f3n en las larvas y no en estad\u00edos previos. Se demostr\u00f3 pues c\u00f3mo algunos da\u00f1os o modificaciones gen\u00e9ticas subletales provocadas por la criopreservaci\u00f3n permanecen en el embri\u00f3n y permiten el correcto desarrollo embrionario, poni\u00e9ndose de manifiesto en etapas posteriores y pudiendo afectar a la funcionalidad de los nuevos individuos.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Alteraciones del adn de espermatozoides de trucha arco-iris (oncorhynchus mykiss) producidas durante la conservaci\u00f3n seminal: consecuencias para la elaboraci\u00f3n de bancos de germoplasma<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Alteraciones del adn de espermatozoides de trucha arco-iris (oncorhynchus mykiss) producidas durante la conservaci\u00f3n seminal: consecuencias para la elaboraci\u00f3n de bancos de germoplasma <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Seraf\u00edn P\u00e9rez Cerezales <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Le\u00f3n<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 11\/06\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Paz Herraez Ortega<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: manuel Carrillo est\u00e9vez <\/li>\n<li>alfonso Gutierrez ad\u00e1n (vocal)<\/li>\n<li>sebastiano Vilella (vocal)<\/li>\n<li>Juan  Francisco Asturiano nemesio (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Seraf\u00edn P\u00e9rez Cerezales La elaboraci\u00f3n de bancos de recursos gen\u00e9ticos ha surgido como respuesta a diversas necesidades 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