{"id":101776,"date":"2018-03-11T10:23:42","date_gmt":"2018-03-11T10:23:42","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/study-of-the-dna-complexation-and-transfection-mediated-by-polycations-and-cationic-liposomes\/"},"modified":"2018-03-11T10:23:42","modified_gmt":"2018-03-11T10:23:42","slug":"study-of-the-dna-complexation-and-transfection-mediated-by-polycations-and-cationic-liposomes","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/santiago-de-compostela\/study-of-the-dna-complexation-and-transfection-mediated-by-polycations-and-cationic-liposomes\/","title":{"rendered":"Study of the dna complexation and transfection mediated by polycations and cationic liposomes"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Manuel Alatorre Meda <\/strong><\/h2>\n<p>Esta tesis, presentada para obtener el t\u00edtulo de doctor en f\u00edsica, es el resultado del trabajo de investigaci\u00f3n que llev\u00e9 a cabo dentro de grupo de investigaci\u00f3n de nanomateriales y materia blanda del departamento de f\u00edsica de la materia condensada de la facultad de f\u00edsica de la universidad de santiago de compostela. El trabajo de investigaci\u00f3n fue dirigido por el dr. Julio r. Rodr\u00edguez gonz\u00e1lez, catedr\u00e1tico de esta universidad. el trabajo aqu\u00ed expuesto describe la caracterizaci\u00f3n fisicoqu\u00edmica del proceso de compactaci\u00f3n de \u00e1cido desoxirribonucleico (adn) mediado por policationes y liposomas cati\u00f3nicos, as\u00ed como la posterior transfecci\u00f3n de los complejos formados hacia c\u00e9lulas eucariotas. la tesis se divide en 7 cap\u00edtulos. En el cap\u00edtulo 1 presenta una introducci\u00f3n general al tema. El cap\u00edtulo 2 presenta una descripci\u00f3n de los materiales y m\u00e9todos empleados. Los cap\u00edtulos 3, 4, 5 presentan los resultados obtenidos de la caracterizaci\u00f3n del quitosano, del cloruro de poli(dialil-dimetil-amonio) (pdadmac) y del metafectene pro (mep) como vectores de adn, respectivamente. El cap\u00edtulo 6 se ocupa de las conclusiones generales extra\u00eddas. Y finalmente, el cap\u00edtulo 7, presentado como un ap\u00e9ndice, expone los resultados obtenidos despu\u00e9s de una cooperaci\u00f3n de nuestro grupo con el grupo de investigaci\u00f3n dirigido por el prof. Bj\u00ed\u00b6rn lindman de la universidad de lund en relaci\u00f3n con la liberaci\u00f3n inducida por ciclodextrinas de adn de complejos adn-tensioactivo, un tema que est\u00e1 estrechamente relacionada con el tema de esta tesis.  1.Introducci\u00f3n el adn ha sido centro de muy especial atenci\u00f3n por los investigadores desde el descubrimiento de su funci\u00f3n como portador de informaci\u00f3n gen\u00e9tica. Miles de genes han sido identificados hasta la fecha en el marco de el proyecto genoma humano (pgh). El pgh, fundado en 1990 bajo la direcci\u00f3n de james d. Watson, es un proyecto internacional de investigaci\u00f3n cient\u00edfica con el objetivo fundamental de determinar la secuencia de pares de bases qu\u00edmicas que componen el adn e identificar los aproximadamente 20,000-25,000 genes del genoma humano desde un punto de vista f\u00edsico y funcional. Este proyecto ha abierto por tanto enormes posibilidades para la medicina; esto es, se ha suscitado una nueva era en la prevenci\u00f3n, diagn\u00f3stico, tratamiento y curaci\u00f3n de las enfermedades.  muchos investigadores consideran la terapia g\u00e9nica como la terapia del siglo 21. La identificaci\u00f3n de mutaciones g\u00e9nicas causantes de enfermedades es una rica fuente de oportunidades para la identificaci\u00f3n de nuevos tratamientos de la enfermedad. Despu\u00e9s de identificar una mutaci\u00f3n y su enfermedad asociada, la comunidad cient\u00edfica estudia la forma y funciones biol\u00f3gicas del correspondiente producto g\u00e9nico alterado (ordinariamente prote\u00edna). Con esta informaci\u00f3n en la mano, se persiguen en la actualidad tres enfoques terap\u00e9uticos principales basados en los genes:  -terapia con c\u00e9lulas madre: se utilizan c\u00e9lulas madre humanas para reparar el tejido da\u00f1ado por la enfermedad.  -terapia de modificaci\u00f3n de arn: el arnm codificado por un gen mutado se dirige a la c\u00e9lula objetivo.  -transfecci\u00f3n: segmentos de adn modificado son dirigidos a la c\u00e9lula objetivo.   transfecci\u00f3n (tambi\u00e9n conocido como liberaci\u00f3n de genes)  la transfecci\u00f3n se basa en el simple concepto de que si una enfermedad es causada por el mal funcionamiento de un gen, dicha enfermedad puede ser revertida por la adici\u00f3n de copias del mismo gen en buen estado de una fuente externa. A pesar de esta simple concepci\u00f3n, el mecanismo de la transfecci\u00f3n sigue sin estar claro hasta la fecha. Mientras que los primeros modelos prev\u00e9n la fusi\u00f3n del complejo adn-vector con las membranas celulares, recientemente, la mayor\u00eda de los investigadores creen que el complejo entra en las c\u00e9lulas por una v\u00eda endoc\u00edtica. hasta ahora, se han utilizado dos estrategias en la liberaci\u00f3n de transgenes (genes que se transmiten del genoma de una especie al genoma de otra):  -ensayos in vivo: el transgen es liberado directamente a las c\u00e9lulas, tejidos u \u00f3rganos de un paciente afectado.  -ensayos in vitro: se requiere la extracci\u00f3n de una poblaci\u00f3n celular del paciente afectado.  Las c\u00e9lulas son alteradas gen\u00e9ticamente para expresar el transgen de inter\u00e9s y luego son trasplantadas de nuevo al paciente.  los ensayos in vitro e in vivo requieren dos elementos fundamentales: i) un pl\u00e1smido, que consiste del transgen de inter\u00e9s y algunas secuencias de adn extra que permiten la expresi\u00f3n del gen en las c\u00e9lulas humanas, y ii) un veh\u00edculo para introducir el transgen en las c\u00e9lulas (denominado vector de transfecci\u00f3n).  aunque aparentemente los enfoques in vitro e in vivo representan biol\u00f3gicamente el mismo proceso, es conveniente describirlos por separado. En lo concerniente a la transfecci\u00f3n in vivo, se han reportado una serie de m\u00e9todos con distintos grados de \u00e9xito.  estos m\u00e9todos incluyen la inyecci\u00f3n directa de pl\u00e1smido en los m\u00fasculos, la liberaci\u00f3n de complejos adn-prote\u00edna, la co-precipitaci\u00f3n de adn con fosfato de calcio, la encapsulaci\u00f3n de adn en diversas formulaciones lip\u00eddicas, y la infecci\u00f3n utilizando vectores retrovirales clonados. Entre ellos, el uso de adn desnudo sin ning\u00fan tipo de vector adherido constituye la estrategia m\u00e1s simple y la m\u00e1s segura. Sin embargo, la r\u00e1pida degradaci\u00f3n del adn debida a ataques enzim\u00e1ticos en la vecindad de la membrana celular, el nivel de expresi\u00f3n es, en general, considerablemente bajo. como se ha mencionado con anterioridad, la interacci\u00f3n del adn con compuestos cati\u00f3nicos en soluciones acuosas conduce a la formaci\u00f3n de complejos qu\u00edmicos de especial importancia para la terapia g\u00e9nica. Dichos compuestos act\u00faan como veh\u00edculos (vectores) para la transfecci\u00f3n de adn. Aunque los vectores de transfecci\u00f3n m\u00e1s eficaces se basan en virus, sin embargo, adolecen de serias limitaciones tales como respuestas inmunol\u00f3gicas adversas del organismo receptor. Debido a su estabilidad en el almacenamiento, a su facilidad de producci\u00f3n y a su facultad de poder ser administrados en repetidas ocasiones con respuestas inmunol\u00f3gicas m\u00ednimas, los vectores de transfecci\u00f3n no virales se han propuesto desde hace algunos a\u00f1os como \u00fanica alternativa segura a los vectores de naturaleza v\u00edrica. Dos tipos principales de vectores no virales actualmente investigados en la actualidad son los pol\u00edmeros- y l\u00edpidos-cati\u00f3nicos.  los polielectrolitos son pol\u00edmeros con grupos ionizables que en disolventes polares tales como el agua o soluciones \u00e1cidas, se disocian dejando iones en la cadena polim\u00e9rica y desprendiendo contraiones en la disoluci\u00f3n. Al mezclarse en una misma disoluci\u00f3n acuosa, los polielectrolitos con carga opuesta interact\u00faan electrost\u00e1ticamente y forman complejos. Este proceso es promovido por un aumento en la entrop\u00eda del sistema debido a la liberaci\u00f3n de contraiones. La transfecci\u00f3n realizada con complejos adn-polielectrolitos cati\u00f3nicos se conoce como polifecci\u00f3n. Los pol\u00edmeros cati\u00f3nicos m\u00e1s estudiados en la actualidad como vectores de transfecci\u00f3n son el quitosano, la polietilenimina, la poli(l-lisina), los poli(beta-amino \u00e9ster) y los dendr\u00edmeros de poliamidoamina. por su parte, la transfecci\u00f3n mediada por l\u00edpidos cati\u00f3nicos se conoce como lipofecci\u00f3n. Antes de ser conducido a las c\u00e9lulas, el adn se ve obligado a interactuar con liposomas, estructuras vesiculares formadas normalmente por una mezcla de un l\u00edpido neutro y un l\u00edpido cati\u00f3nico. La ventaja de la lipofecci\u00f3n sobre otras t\u00e9cnicas tales como la polifecci\u00f3n, es que los liposomas constituyen herramientas \u00fatiles para ensayos precl\u00ednicos y cl\u00ednicos debido a su biodegradabilidad, baja inmunogenicidad y a la facilidad con la que pueden ser producidos a gran escala. Adem\u00e1s, de forma similar a los policationes (y contrario a los vectores de naturaleza v\u00edrica), los liposomas cati\u00f3nicos tienen la capacidad de transferir adn de tama\u00f1o ilimitado. Desafortunadamente, aparte de todas estas caracter\u00edsticas favorables, se debe admitir que existen algunos inconvenientes inherentes a lipofecci\u00f3n. Dichos incovenientes son: i) su eficacia es impredecible y depende de diferentes factores tales como la composici\u00f3n de los liposomas, las condiciones de preparaci\u00f3n, el tama\u00f1o y la carga superficial, la v\u00eda de introducci\u00f3n del complejo hacia los cultivos celulares, y ii) la escasez de conocimiento de los aspectos fisicoqu\u00edmicos envueltos en la interacci\u00f3n adn-liposoma cati\u00f3nico. En la literatura se describen cuatro conformaciones principales de los complejos adn-liposoma cati\u00f3nico (tambi\u00e9n llamados lipoplejos): una con una estructura lamelar de corto alcance compuesta por bicapas lip\u00eddicas planas y el adn empaquetado entre ellas, otra donde las mol\u00e9culas de adn est\u00e1n encapsuladas dentro de una bicapa lip\u00eddica formando complejos cil\u00edndricos que est\u00e1n empacados en una red hexagonal, una tercera donde las ves\u00edculas con carga positiva est\u00e1n interconectadas por mol\u00e9culas extendidas de adn, modelo conocido como collar de perlas, y finalmente otra en la que se sugiere que la mol\u00e9cula de adn se compacta a una forma globular y se adhiere a la superficie externa de las ves\u00edculas con carga positiva. Lo que se puede concluir de los cuatro casos, cualquiera que sea la naturaleza de las interacciones, es que a concentraciones diluidas ning\u00fan cambio estructural se hace presente en los sistemas; es decir, no hay cambio aparente en la ves\u00edcula. Mientras que a concentraciones elevadas la situaci\u00f3n se torna diferente en cuanto que las ves\u00edculas tienden a coalescer y flocular.  a pesar de la disparidad de criterios tocantes a las interacciones adn-liposoma, existen en el mercado m\u00e1s de 50 kits comerciales para la transfecci\u00f3n de \u00e1cidos nucleicos. Uno de estos productos es el metafectene pro. Mep es una formulaci\u00f3n basada en una poliamina, un l\u00edpido cati\u00f3nico. Como l\u00edpido neutro estabilizante, mep contiene la dioleil-fosfatidiletanolamina (dope por sus siglas en ingl\u00e9s). Mep pertenece a una nueva clase de reactivos de transfecci\u00f3n basados en la tecnolog\u00eda de acid\u00f3lisis repulsiva de membrana (rma por sus siglas en ingl\u00e9s). La tecnolog\u00eda rma desarrollada por biontex permite al adn escapar del lipoplejo adn-mep una vez que \u00e9ste es absorbido por el endosoma. El entorno \u00e1cido provoca que el mep se separe de su carga. Las fuerzas de repulsi\u00f3n electrost\u00e1tica entre las diferentes partes de igual carga positiva del mismo mep generan una rotura en la membrana del endosoma llevando en consecuencia a  la liberaci\u00f3n del material gen\u00e9tico.   en el presente trabajo se han caracterizados como vectores de transfecci\u00f3n de adn dos familias de policationes (poliaminas), el quitosano y el cloruro de poli(dialil-dimetil-amonio) (pdadmac), y adem\u00e1s una formulaci\u00f3n lip\u00eddica ampliamente utilizada a nivel mundial en ensayos de transfecci\u00f3n, metafectene pro. Los estudios fueron realizados variando distintas condiciones experimentales tales como el ph, la estructura qu\u00edmica y el peso molecular de los vectores cati\u00f3nicos. para ello se emplearon una bater\u00eda de m\u00e9todos experimentales. Los m\u00e9todos principales incluyeron la conductivimetr\u00eda, movilidad electrofor\u00e9tica, dispersi\u00f3n din\u00e1mica de luz, calorimetr\u00eda isot\u00e9rmica de titulaci\u00f3n, microscop\u00eda de fuerza at\u00f3mica, microscop\u00eda electr\u00f3nica de transmisi\u00f3n, el crecimiento de c\u00e9lulas en cultivo y la expresi\u00f3n g\u00e9nica. Los m\u00e9todos complementarios incluyeron las determinaciones de viscosidad, densidad, velocidad del sonido, etc. en la formaci\u00f3n de complejos se evalu\u00f3 el efecto de la densidad de carga y Valencia cati\u00f3nica. Para los complejos adn-vector fueron determinados seis par\u00e1metros: i) el radio hidrodin\u00e1mico, rh, ii) su estabilidad con el tiempo, iii) la raz\u00f3n vector\/adn a la cual las interacciones electrost\u00e1ticas ten\u00edan comienzo tanto para los complejos adn-policati\u00f3n como para el complejo adn-liposoma, iv) el potencial z, v) la energ\u00e9tica de formaci\u00f3n de los complejos, y vi) su morfolog\u00eda. En cuanto a la eficiencia de transfecci\u00f3n, fueron ensayados para la expresi\u00f3n de beta-galactosidasa los complejos con caracter\u00edsticas m\u00e1s prometedoras (es decir, part\u00edculas compactas con valores de potencial z positivos).   2. Resultados  2.1 adn-quitosano: formaci\u00f3n de complejos y eficiencia de la transfecci\u00f3n  se estudiaron tres quitosanos de diferentes viscosidades (baja, media y alta) como vectores de adn. Antes de la experimentaci\u00f3n, se determin\u00f3 peso molecular, mw, de cada quitosano en base a la medida de viscosidades y por medio de la ecuaci\u00f3n de mark-houwink. Los quitosanos fueron identificados de acuerdo con sus pesos moleculares y representados abreviadamente como c(689), c(1652) y c(2901) correspondiendo a los quitosanos de baja, media y alta viscosidad, respectivamente.  el estudio de los complejos adn-quitosano se llev\u00f3 a cabo en dos pasos. En primer lugar, la formaci\u00f3n del complejo fue estudiada por dispersi\u00f3n din\u00e1mica de luz (dls por sus siglas en ingl\u00e9s). El estudio se realiz\u00f3 con el objetivo de caracterizar el efecto del ph del medio y el peso molecular del quitosano (es decir, el efecto de la densidad de carga y Valencia del quitosano) sobre las caracter\u00edsticas estructurales de los complejos formados.  asimismo, la calidad de todas las funciones de autocorrelaci\u00f3n fue confirmada por el c\u00e1lculo del factor de coherencia del instrumento, f. Los factores de coherencia calculados a partir de nuestros datos experimentales se encontraron en el rango de 0,746 \u00c2\u00bf f \u00c2\u00bf 0,790. Para las soluciones quitosano y adn y las mezclas con n\/p < 1, los factores de coherencia no se calcularon debido a la ausencia de l\u00ednea base.  se demostr\u00f3 que los complejos adn-quitosano obtenidos son estables a partir de un valor m\u00ednimo de n\/p, que denominamos (n\/p)c, y que el ph y mw influyen en el cociente n\/p y  en rh, respectivamente. Se encontr\u00f3 que cuanto m\u00e1s alto era el ph, mayor era la cantidad de quitosano necesaria para la formaci\u00f3n del complejo, un efecto que fue especialmente pronunciado para el quitosano de m\u00e1s alto peso molecular c(2901).  asimismo, se encontr\u00f3 que con el aumento de mw, el tama\u00f1o de los complejos aumenta de forma lineal. En general, los complejos adn-quitosano presentan tama\u00f1os estables y reproducibles estando rh en torno a los 190-250nm para n\/p \u00c2\u00bf (n\/p)c.  en segundo lugar, y con base en los resultados obtenidos del estudio de dispersi\u00f3n de luz que sugieren que a phs \u00e1cidos la formaci\u00f3n de complejos se torna favorable, se desarroll\u00f3 una caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica completa del proceso de formaci\u00f3n de los complejos adn-quitosano. Se determinaron los valores de potencial, energ\u00edas de enlace y morfolog\u00eda de los complejos. Adem\u00e1s, se evalu\u00f3 de la eficiencia de la transfecci\u00f3n de estos complejos. los complejos mostraron valores de potencial z alrededor de 16 mv y un enlace de naturaleza entr\u00f3pica. Esto \u00faltimo sugiere una asociaci\u00f3n electrost\u00e1tica promovida por la liberaci\u00f3n de contraiones durante el enlace. En cuanto a su morfolog\u00eda, tem y afm revelaron que los complejos adoptan una morfolog\u00eda de n\u00facleo-coraza donde los gl\u00f3bulos\/agregados est\u00e1n rodeados por hebras que aparentemente salen del interior del complejo. En lo que se refiere a la transfecci\u00f3n, la expresi\u00f3n beta-galactosidasa parece aumentar con la Valencia del quitosano (masa molecular), sin embargo, las tasas de transfecci\u00f3n de los complejos adn-quitosano son notablemente inferiores en comparaci\u00f3n con el complejo adn-mep. Considerando en conjunto la morfolog\u00eda de los complejos, sus valores de potencial z marcadamente positivos y la baja eficiencia en la transfecci\u00f3n, suponemos que en la morfolog\u00eda n\u00facleo-coraza observada, la cadena adn debe estar empacada en el interior del complejo siendo rodeada por las cadenas quitosano. Cabe mencionar que esta estructura ha sido reportada como muy recurrente en sistemas en los cuales el policati\u00f3n (en este caso el quitosano) se encuentra presente en exceso con respecto al adn.   2.2 adn-pdadmac: formaci\u00f3n de complejos y eficiencia de la transfecci\u00f3n  al igual que con el quitosano, se evalu\u00f3 la influencia de la densidad de carga (cd) y la Valencia del policati\u00f3n pdadmac en la formaci\u00f3n de complejos y eficiencia de la transfecci\u00f3n. Fueron estudiados cuatro homo-pol\u00edmeros (cd = 1, con Valencias diferentes) y un copol\u00edmero, poli(cloruro de acrilamida-co-dialil dimetil amonio) (codadmac) (cd <1, con Valencia equivalente a uno de los homopol\u00edmeros). Para simplificar, los pdadmacs fueron identificados como p(1, <619), p(1, 929), p(1, 1703), p(1, 2786), y p(0,26, 668) donde el primer y segundo t\u00e9rminos en el par\u00e9ntesis denotan la densidad de carga y Valencia, respectivamente.  se detectaron dos razones caracter\u00edsticas de pdadmac en adn. Experimentos de itc y conductivimetr\u00eda revelaron que la raz\u00f3n de compactaci\u00f3n del adn, (n\/p)c, se rige principalmente por cd. Mientras tanto, seg\u00fan lo observado por las experiencias de dls, la raz\u00f3n molar a la cual los complejos alcanzaron la mayor compactaci\u00f3n (el menor tama\u00f1o) (n\/p)*, fue determinada por la Valencia del pdadmac.  al igual que los complejos adn-quitosano, los complejos adn-pdadmac presentaron un enlace de naturaleza entr\u00f3pica. Se formaron estructuras compactas y estables (rh ~ 100 nm) con valores de potencial z positivos (~ 11 mv), pero bajas eficiencias de transfecci\u00f3n en comparaci\u00f3n con el lipoplejo adn-metafectene pro. En la determinaci\u00f3n de las eficiencias de transfecci\u00f3n de estos complejos se volvieron a observar bajas expresiones de beta-galactosidasa, que de nuevo pueden ser atribuidas a una posible conformaci\u00f3n n\u00facleo-coraza en el complejo. Los complejos formados presentaron una estructura toroidal.  2.3 formaci\u00f3n de complejos adn-mep  con base en su alta eficiencia como vector de transfecci\u00f3n hacia c\u00e9lulas eucariotas, mep se utiliz\u00f3 como blanco positivo en ensayos de transfecci\u00f3n de adn. En comparaci\u00f3n con la eficiencia de la transfecci\u00f3n de los complejos adn-quitosano y adn-mep, la eficiencia de la transfecci\u00f3n del complejo adn-mep es marcadamente superior. Por ende,  era de nuestro inter\u00e9s el caracterizar el proceso de formaci\u00f3n de complejos adn-mep. Se llev\u00f3 a cabo una caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica de las interacciones adn-mep en torno a la relaci\u00f3n de masa recomendada para la transfecci\u00f3n (l \/ d = 700) a un ph de 6.5 (10 mm bis-tris) ya una temperatura de 25 \u00c2\u00ba c.  un marcado incremento en la intensidad de la luz dispersada por los complejos a valores (l\/d)c aprox. 600 muestra que esta es la zona en la que comienzan a formarse los complejos. Este resultado valida la zona reportada por biontex como la \u00f3ptima para la realizaci\u00f3n de los estudios de transfecci\u00f3n ((l\/d) = 700). Los resultados de dls demuestran que los complejos tienen un tama\u00f1o promedio de 135 nm y que se mantuvieron estables por al menos siete d\u00edas. En lo que concierne a la morfolog\u00eda, afm y tem muestran complejos en acuerdo al modelo conocido como collar de perlas donde las ves\u00edculas parecen ser interconectadas por hebras de adn. Finalmente y en nuestra opini\u00f3n lo m\u00e1s importante, los resultados de potencial z demuestran  que la condici\u00f3n de isoneutralidad no es alcanzada por los complejos a las concentraciones a las cuales la transfecci\u00f3n es satisfactoriamente implementada; es m\u00e1s, ellos presentan un potencial z marcadamente negativo. Este resultado sugiere que la entrada al n\u00facleo celular no es debida a un proceso de endocitosis exclusivamente, por lo que se especula que esta entrada del complejo a la c\u00e9lula puede estar mediada por un proceso de fagocitosis.    3. Conclusiones generales y trabajo a futuro en la presente tesis los policationes quitosano y cloruro de poli(dialildimetilamonio) (pdadmac) y el liposoma cati\u00f3nico metafectene pro se estudiaron como vectores de adn para terapia g\u00e9nica. Se siguieron e interpretaron los procesos de formaci\u00f3n de complejos as\u00ed como su transfecci\u00f3n al interior celular. Se evaluaron las magnitudes importantes para el proceso de transfecci\u00f3n, sus caracter\u00edsticas estructurales, electroqu\u00edmicas y energ\u00e9ticas, prestando especial atenci\u00f3n al efecto de la densidad de carga (cd) y a la Valencia de los policationes. La eficiencia de la transfecci\u00f3n fue analizada en base a la expresi\u00f3n de la beta-galactosidasa.   3.1 conclusiones generales  los sistemas adn-quitosano y adn-pdadmac revelaron buenas propiedades coloidales y caracter\u00edsticas fisicoqu\u00edmicas muy similares uno con respecto al otro. Despu\u00e9s de su interacci\u00f3n con adn, ambos formaron complejos lo suficientemente peque\u00f1os como para ser captados la interior celular por endocitosis. Sin embargo, su eficiencia de transfecci\u00f3n fue notablemente baja en comparaci\u00f3n a la del lipoplejo adn-mep. Con los resultados experimentales que aqu\u00ed se presentan se observa que \u00e9sta baja eficiencia de transfecci\u00f3n encuentra explicaci\u00f3n en la alta afinidad del enlace adn-policati\u00f3n, aunada con la conformaci\u00f3n estructural que los poliplejos adoptan en soluci\u00f3n. los hallazgos m\u00e1s importantes se enumeran a continuaci\u00f3n.  a) poliplejos adn-quitosano tres quitosanos de Valencias diferentes (689, 1652, y 2901) fueron estudiados a tres valores de ph distintos, 5, 6 y 6.5 (tres distintas densidades de carga).  los principales resultados dispersi\u00f3n de luz son los siguientes:  1) la densidad de carga del quitosano juega un papel importante en la formaci\u00f3n de complejos de adn. A ph 5 y 6 el cociente (n\/p)c de todos los poliplejos fue inferior a 2 (como tambi\u00e9n fue demostrado por los resultados de conductividad, potencial z e itc). Sin embargo a un ph de 6.5 los poliplejos con quitosano de Valencias 1652 y 2901 presentaron complejos compactos y estables s\u00f3lo a (n\/p)c \u00c2\u00bf 6. Esto se explica por el hecho de que a medida que el ph se acerca al  pka del quitosano, la neutralizaci\u00f3n de carga de los grupos amino da lugar a una mayor cantidad de quitosano necesaria para la formaci\u00f3n de complejos con adn. 2) se encontr\u00f3 que el tama\u00f1o de los complejos est\u00e1 fuertemente relacionado con la Valencia del quitosano, al tiempo que es independiente de su densidad de carga. Se demostr\u00f3 que el crecimiento del radio hidrodin\u00e1mico con la Valencia segu\u00eda una tendencia lineal, los poliplejos formados con los quitosanos c(689), c(1652), y c(2901) presentaron tama\u00f1os de 187 +\/- 21, 210 +\/- 11, y 246 +\/- 13 nm, respectivamente. La explicaci\u00f3n a este fen\u00f3meno es que a medida que la masa molecular del quitosano aumenta, los complejos que forma con el adn son menos solubles.  3) en lo que se refiere a la estabilidad de los complejos, para valores n\/p = 6, \u00e9stos demostraron ser estables por un periodo de al menos 6 d\u00edas.  trabajar a ph bajo puede ser una ventaja debido a que  se necesitan concentraciones m\u00e1s bajas de quitosano para compactar al adn. En consecuencia, como un segundo paso en nuestro estudio, hemos caracterizado la influencia de la Valencia del quitosano pero centr\u00e1ndonos ahora en la formaci\u00f3n de complejos en condiciones de acidez (ph 5). Los m\u00e9todos experimentales que hemos utilizado fueron la movilidad electrofor\u00e9tica, itc, afm, tem y ensayos de onpg.  4) todos los poliplejos, independientemente de la Valencia del quitosano, dieron valores positivos de potencial z en torno a los 16 mv y morfolog\u00edas del tipo cepillo, como fue demostrado por los resultados de movilidad electrofor\u00e9tica, tem y afm, respectivamente. Considerando en conjunto estos resultados podemos especular con la posibilidad de que los poliplejos adopten una estructura de n\u00facleo-coraza t\u00edpica de sistemas formados por polielectrolitos. Este modelo establece que el adn se condensa en la parte interior del poliplejo mediante la uni\u00f3n de segmentos cortos de un gran n\u00famero de cadenas de policati\u00f3n, mientras que los segmentos restantes de estas mismas cadenas se espera que se encuentren libres en la parte externa del complejo dando lugar a cargas superficiales notablemente positivas. 5) la afinidad de enlace entre el adn y el quitosano fue estudiada mediante calorimetria (itc). Las constantes de enlace obtenidas fueron del orden de 10 e5 - 10 e6 y 10 e3 - 10 e4 1\/m para el primer y segundo sitio de uni\u00f3n, respectivamente. Se encontr\u00f3 una tendencia decreciente de la constante k con la Valencia. Este resultado refuerza nuestra hip\u00f3tesis de que la Valencia del quitosano dificulta hasta cierto punto la formaci\u00f3n de complejos (como se muestra por la tendencia lineal de rh con mw representado por dls). 6) verificamos que el proceso de enlace es exot\u00e9rmico en todos los casos. Al momento que las cargas negativas del adn iban siendo neutralizadas por las cadenas de quitosano se observ\u00f3 una disminuci\u00f3n en el calor de enlace liberado. La zona de estabilizaci\u00f3n de calor liberado corresponde a  la de la completa condensaci\u00f3n del adn. Los complejos formados por los quitosanos c(689) y c(1652) mostraron una (n\/p)c ~ 0,5 mientras que para c(2901), (n\/p)c ~ 1. 7) el proceso de enlace demostr\u00f3 tener una naturaleza entr\u00f3pica. Este resultado es t\u00edpicamente observado en interacciones electrost\u00e1ticas de polielectrolitos donde el proceso es promovido por la liberaci\u00f3n de contriones (deltas1 ~ 0.2, and deltas2 ~ 0.1 en todos los casos). 8) finalmente, la tasa de transfecci\u00f3n del complejo adn-quitosano a las c\u00e9lulas hela se determin\u00f3 mediante la expresi\u00f3n de la beta-galactosidasa. Se estudiaron complejos y nanoesferas con distintos valores de n\/p. En general, la eficiencia de la transfecci\u00f3n de los complejos (y nanoesferas) result\u00f3 ser muy inferior en comparaci\u00f3n con la del lipoplejo adn-mep utilizado como control. La baja tasa de transfecci\u00f3n se explica en virtud de los resultados de potencial z, tem y afm (que sugieren la estructura n\u00facleo-coraza), e itc (que demuestra una alta afinidad de enlace).  b) complejos adn-pdadmac se analizaron cuatro homopol\u00edmeros dadmac (cd = 1, con Valencias diferentes) y un co-pol\u00edmero, cloruro de poli(acrilamida-co-dialildimetilamonio) (codadmac) (cd <1  y Valencia equivalente a uno de los homopol\u00edmeros). 1) se observ\u00f3 que la densidad de carga es la propiedad que gobierna el cociente cr\u00edtico (n\/p)c. Los resultados de itc, conductividad y potencial z revelaron que los complejos formados a partir de los homopol\u00edmeros dan una raz\u00f3n molar (n\/p)c de aproximadamente la mitad del correspondiente al codadmac (cd = 0.26). Este resultado est\u00e1 en concordancia con lo observado a partir de los complejos formados con quitosano. 2) se encontr\u00f3 que el tama\u00f1o de los complejos est\u00e1 estrechamente relacionado con la Valencia del pdadmac, al mismo tiempo que es independiente de la densidad de carga. Los poliplejos formados con pdadmacs p(1, <619), p(1, 929), p(1, 1703), p(1, 2786), y p(0,26, 668) produjeron tama\u00f1os de 79.4 +\/- 2.1, 87 +\/- 6,9 y 108,9 +\/- 12.5, 112.6 +\/- 9.7 y 199.8 +\/- 23.5 nm, respectivamente. Se confirma as\u00ed la hip\u00f3tesis de que hasta cierto punto la influencia de la densidad de carga se ve afectada por una disminuci\u00f3n de la solubilidad cuando se trabaja con pol\u00edmeros de alto peso molecular. De la misma forma, el hecho de que los complejos formados con p(0.26, 668) mostraran radios hidrodin\u00e1micos m\u00e1s altos en todo el intervalo de concentraciones puede explicarse por la presencia de la acrilamida en la cadena polim\u00e9rica. La acrilamida tiene una alta capacidad hidrof\u00edlica.  3) se observa una reducci\u00f3n en el tama\u00f1o de los complejos con el tiempo. Esta caracter\u00edstica se acent\u00faa con el incremento de la Valencia del pdadmac, debido a que aumenta flexibilidad de la cadena polim\u00e9rica. 4) todos los poliplejos, independientemente de la Valencia y densidad de carga del pdadmac, presentaron  valores de potencial z de alrededor de 12 mv y morfolog\u00edas toroidales como se demostr\u00f3 mediante la movilidad electrofor\u00e9tica y afm, respectivamente. Una vez m\u00e1s se infiere una estructura n\u00facleo-coraza con el adn compactado en el interior del complejo. 5) en lo que se refiere a las contribuciones energ\u00e9ticas la formaci\u00f3n de los complejos result\u00f3 ser de naturaleza entr\u00f3pica  y con una alta afinidad de enlace (al igual que en el sistema adn-quitosano). Sin embargo, a diferencia del caso de los complejos adn-quitosano, las contribuciones ent\u00e1lpicas para los complejos adn-p(1, <619) y adn-p(1, 929) se presentan con car\u00e1cter endot\u00e9rmico demostrando que junto a las interacciones electrost\u00e1ticas antes descritas, tambi\u00e9n tienen lugar interacciones de tipo hidr\u00f3fobo. Se identificaron tres etapas distintas a lo largo del proceso de enlace. En primer lugar, el inicio de la saturaci\u00f3n de adn se caracteriz\u00f3 por la presencia de un comportamiento bif\u00e1sico en los termogramas; en segundo lugar, el colapso de adn fue caracterizado por un incremento en el calor absorbido (deltah endot\u00e9rmico) con un subsecuente descenso en la entalp\u00eda y por \u00faltimo, las interacciones pol\u00edmero-pol\u00edmero y complejo-pol\u00edmero fueron caracterizadas por una transici\u00f3n de tipo exot\u00e9rmica despu\u00e9s de la saturaci\u00f3n completa de los grupos fosfato. 6) finalmente, la eficiencia de la transfecci\u00f3n se vio favorecida en los poliplejos formados con pdadmacs de Valencias bajas (especialmente para los n\/p \u00c2\u00bf 6), sin embargo, la tasa de transfecci\u00f3n en general puede ser considerada como baja en comparaci\u00f3n con el lipoplejo adn-mep. El motivo por el cual la tasa de la transfecci\u00f3n es baja (como en el caso del quitosano) se atribuye de nuevo a la alta afinidad entre el adn y pdadmac, junto con la conformaci\u00f3n n\u00facleo-coraza anteriormente citada.  c) lipoplejos adn-mep vs. Poliplejos adn-quitosano y adn-pdadmac en las condiciones de la transfecci\u00f3n los lipoplejos presentaron las siguientes caracter\u00edsticas: 1) un radio hidrodin\u00e1mico promedio en torno a 135 nm. 2) una conformaci\u00f3n del tipo collar de perla con hebras de adn saliendo de las superficies de la ves\u00edcula y presumiblemente conectando un liposoma con otro. 3) en lo que consideramos uno de los resultados m\u00e1s interesantes, un valor de potencial z en torno a -45 mv. en lo que al tama\u00f1o del complejo se refiere, en general se cree que la captaci\u00f3n celular del complejo se ve facilitada a medida que las dimensiones de este \u00faltimo se hacen m\u00e1s peque\u00f1as.  teniendo en cuenta que el tama\u00f1o del lipoplejo adn-mep (135 nm) es equivalente a los reflejados por los sistemas adn-quitosano (190-250 nm) y adn-pdadmac (80-115 nm), se puede afirmar que los bajos valores de transfecci\u00f3n de los poliplejos no se deben a un factor de tama\u00f1o.  las principales diferencias entre poliplejos y lipoplejos se ven reflejadas en la morfolog\u00eda y en el potencial z. Analizando en primer lugar la morfolog\u00eda de la lipoplejos, se observa que el adn no est\u00e1 completamente recubierto por los liposomas, es decir, algunos segmentos de adn son accesibles para el entorno del complejo. Este resultado es en cierto modo contradictorio y merece ser estudiado en un mayor detalle. Es evidente que el mecanismo de liberaci\u00f3n del endosoma (dentro del n\u00facleo celular) se debe ver facilitado por el hecho de que el adn se encuentra parcialmente descubierto a priori. Sin embargo, durante el proceso de internalizaci\u00f3n a la celula, los  segmentos expuestos de adn son propensos a degradaci\u00f3n enzim\u00e1tica. En relaci\u00f3n a los resultados de potencial z obtenidos para los lipoplejos (valores negativos), el proceso de internalizaci\u00f3n de este tipo de complejos no est\u00e1 bien documentado, aunque algunos autores han propuesto una v\u00eda fagocit\u00f3tica.  3.2 trabajo futuro como ya se ha demostrado, los vectores cati\u00f3nicos aqu\u00ed estudiados (quitosano y pdadmac) formaron complejos con el adn con unas prometedoras caracter\u00edsticas para su uso en transfecci\u00f3n (es decir, part\u00edculas estables y compactas, con valores de potencial z positivos). Sin embargo, como hemos puesto de manifiesto la eficiencia de transfecci\u00f3n fue m\u00e1s bien baja. a la luz de los resultados obtenidos, una comprensi\u00f3n m\u00e1s profunda tanto del mecanismo de internalizaci\u00f3n celular de los complejos como del proceso de de-compactaci\u00f3n del adn dentro de la c\u00e9lula debe, en nuestra opini\u00f3n, lograrse con el fin de mejorar el proceso de transfecci\u00f3n. Aunque se han hecho algunos trabajos pioneros en este sentido, surge la necesidad de un enfoque racional para el control del proceso. Un siguiente paso a este trabajo seria el estudio del mecanismo de captaci\u00f3n celular de los poliplejos, as\u00ed como la de-compactaci\u00f3n del adn en el interior celular.\n\n\n\n&nbsp;\n\n\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Study of the dna complexation and transfection mediated by polycations and cationic liposomes<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Study of the dna complexation and transfection mediated by polycations and cationic liposomes <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Manuel Alatorre Meda <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 18\/06\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Julio R. Rodr\u00edguez Gonz\u00e1lez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: victor Mosquera tallon <\/li>\n<li>barbara Krajewska (vocal)<\/li>\n<li>ulf Olsson (vocal)<\/li>\n<li>Elena Junquera gonz\u00e1lez (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Manuel Alatorre Meda Esta tesis, presentada para obtener el t\u00edtulo de doctor en f\u00edsica, es el resultado [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"ast-content-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"footnotes":""},"categories":[1157,20151,3733,6153,977],"tags":[206722,206723,206721,206720,83251,35051],"class_list":["post-101776","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-fisica-de-coloides","category-fisica-del-estado-liquido","category-quimica-de-coloides","category-quimica-fisica-de-polimeros","category-santiago-de-compostela","tag-barbara-krajewska","tag-elena-junquera-gonzalez","tag-julio-r-rodriguez-gonzalez","tag-manuel-alatorre-meda","tag-ulf-olsson","tag-victor-mosquera-tallon"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/101776","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=101776"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/101776\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=101776"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=101776"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=101776"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}