{"id":103332,"date":"2018-03-11T10:25:51","date_gmt":"2018-03-11T10:25:51","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/visualizacion-de-interacciones-moleculares-dinamica-del-calcio-y-topologa%c2%ada-de-protea%c2%adnas-de-membrana-en-celulas-vivas-con-protea%c2%adnas-fluorescentes\/"},"modified":"2018-03-11T10:25:51","modified_gmt":"2018-03-11T10:25:51","slug":"visualizacion-de-interacciones-moleculares-dinamica-del-calcio-y-topologa%c2%ada-de-protea%c2%adnas-de-membrana-en-celulas-vivas-con-protea%c2%adnas-fluorescentes","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/biologia-celular\/visualizacion-de-interacciones-moleculares-dinamica-del-calcio-y-topologa%c2%ada-de-protea%c2%adnas-de-membrana-en-celulas-vivas-con-protea%c2%adnas-fluorescentes\/","title":{"rendered":"Visualizaci\u00f3n de interacciones moleculares, din\u00e1mica del calcio y topolog\u00eda de prote\u00ednas de membrana en c\u00e9lulas vivas con prote\u00ednas fluorescentes"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Beatriz Domingo Moreno <\/strong><\/h2>\n<p>El objetivo general de este trabajo es el dise\u00f1o y aplicaci\u00f3n de construcciones basadas en prote\u00ednas fluorescentes para medir diferentes variables fisiol\u00f3gicas y bioqu\u00edmicas, como son la concentraci\u00f3n de ca2+, interacciones prote\u00edna:prote\u00edna, y la topolog\u00eda de prote\u00ednas de membrana, mediante t\u00e9cnicas de imagen en c\u00e9lula viva. la sensibilidad del fen\u00f3meno fret a cambios en la distancia entre mol\u00e9culas fluorescentes en el rango de 1-10 nm, unida a los avances en microscop\u00eda y la utilizaci\u00f3n de las pfs, ha permitido explorar las relaciones \u00edntimas entre mol\u00e9culas dentro de la c\u00e9lula viva, con preservaci\u00f3n de sus funciones y una alta resoluci\u00f3n espacial y temporal.  Existen muchas maneras de aplicar la t\u00e9cnica de fret a un determinado problema biol\u00f3gico y las \u00e1reas de investigaci\u00f3n susceptibles de estudio son innumerables.  El \u00e9xito depender\u00e1 en muchos casos de la elecci\u00f3n del dise\u00f1o experimental y del m\u00e9todo de cuantificaci\u00f3n apropiados. la primera parte de este trabajo est\u00e1 dedicada a la valoraci\u00f3n de varios m\u00e9todos de cuantificaci\u00f3n de fret, y en ella se exponen algunos casos pr\u00e1cticos.  Mediante la construcci\u00f3n de est\u00e1ndares de fret compararemos cuantitativamente cuatro de estos m\u00e9todos: ratio de emisiones, recuperaci\u00f3n del donante por fotodestrucci\u00f3n del aceptor, c\u00e1lculo de emisi\u00f3n sensibilizada por separaci\u00f3n espectral, y disminuci\u00f3n del tiempo de vida media del estado excitado del donante.  Adem\u00e1s, se implementar\u00e1 el m\u00e9todo de los 3-cubos en imagej mediante la generaci\u00f3n de macroinstrucciones para automatizar el c\u00e1lculo de eficiencia de fret p\u00edxel-por-p\u00edxel y en pilas de im\u00e1genes de gran tama\u00f1o.  A continuaci\u00f3n, se intentar\u00e1 monitorizar interacciones moleculares de car\u00e1cter din\u00e1mico, espacial y temporalmente, mediante fret:  1) h-ras:raf por el m\u00e9todo de los 3-cubos en c\u00e9lulas vivas, y 2) la interacci\u00f3n grb2:hspry2 por fotodestrucci\u00f3n del aceptor en c\u00e9lulas fijadas.  Por otra parte, utilizaremos algunos de los est\u00e1ndares mencionados para observar si la eficiencia de fret, calculada por varios m\u00e9todos, es dependiente de la concentraci\u00f3n de las pfs en el interior de la c\u00e9lula; as\u00ed mismo, comprobaremos el efecto de la mutaci\u00f3n a206k sobre tal dependencia. en la segunda parte del estudio, est\u00e1bamos interesados en medir simult\u00e1neamente se\u00f1ales de ca2+ originadas en dos compartimentos celulares distintos utilizando el sensor bioluminiscente aequorina. Para ello se fusionar\u00e1 aequorina con pfs verde o roja, de forma que haya transferencia de energ\u00eda entre aequorina y la pf, y la emisi\u00f3n procedente de cada compartimento sea de diferente color.  Se usar\u00e1n secuencias apropiadas para dirigir la expresi\u00f3n de las aequorinas quim\u00e9ricas a varios dominios subcelulares. en la tercera parte de esta memoria, se propone un m\u00e9todo para verificar la topolog\u00eda de prote\u00ednas, o dominios de \u00e9stas, asociadas a membranas celulares.  Se dise\u00f1ar\u00e1n una serie de construcciones de orientaci\u00f3n conocida para la demostraci\u00f3n y calibraci\u00f3n del m\u00e9todo.  A continuaci\u00f3n se aplicar\u00e1 el m\u00e9todo para revelar la posici\u00f3n de ciertos dominios de dos prote\u00ednas asociadas a membrana: una variante truncada del receptor de somatostatina, y una versi\u00f3n de gpbp de 91 kda, iniciada por traducci\u00f3n no can\u00f3nica del arnm.  Del mismo modo, cuantificaremos la proporci\u00f3n de isoformas de la prote\u00edna pri\u00f3nica (prpc) generadas a partir de la introducci\u00f3n de varias mutaciones en su secuencia.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Visualizaci\u00f3n de interacciones moleculares, din\u00e1mica del calcio y topolog\u00eda de prote\u00ednas de membrana en c\u00e9lulas vivas con prote\u00ednas fluorescentes<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Visualizaci\u00f3n de interacciones moleculares, din\u00e1mica del calcio y topolog\u00eda de prote\u00ednas de membrana en c\u00e9lulas vivas con prote\u00ednas fluorescentes <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Beatriz Domingo Moreno <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Castilla-la mancha<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 26\/07\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Juan Llopis Borr\u00e1s<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Mar\u00eda Gasset vega <\/li>\n<li>ricardo S\u00e1nchez prieto (vocal)<\/li>\n<li>sergi Padilla parra (vocal)<\/li>\n<li>Francisco Javier Diez guerra (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Beatriz Domingo Moreno El objetivo general de este trabajo es el dise\u00f1o y aplicaci\u00f3n de construcciones basadas 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