{"id":103398,"date":"2018-03-11T10:25:56","date_gmt":"2018-03-11T10:25:56","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudio-de-la-regulacion-de-genes-en-celulas-de-alimentacion-de-nematodos-endoparasitos-sedentarios-para-su-futuro-empleo-como-herramientas-biotecnologicas-de-control\/"},"modified":"2018-03-11T10:25:56","modified_gmt":"2018-03-11T10:25:56","slug":"estudio-de-la-regulacion-de-genes-en-celulas-de-alimentacion-de-nematodos-endoparasitos-sedentarios-para-su-futuro-empleo-como-herramientas-biotecnologicas-de-control","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/biotecnologia\/estudio-de-la-regulacion-de-genes-en-celulas-de-alimentacion-de-nematodos-endoparasitos-sedentarios-para-su-futuro-empleo-como-herramientas-biotecnologicas-de-control\/","title":{"rendered":"Estudio de la regulacion de genes en celulas de alimentacion de nematodos endoparasitos sedentarios para su futuro empleo como herramientas biotecnologicas de control"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Alejandra Garcia Ruiz <\/strong><\/h2>\n<p>Los nematodos endopar\u00e1sitos sedentarios de plantas producen importantes p\u00e9rdidas econ\u00f3micas en la agricultura. Entre ellos destaca el g\u00e9nero meloidogyne, que afecta a una amplia variedad de cultivos y est\u00e1 ampliamente distribuido por todo el mundo. Estos nematodos seleccionan varias c\u00e9lulas del cilindro vascular de la ra\u00edz (4-8) y las modifican de modo que experimentan sucesivas mitosis con citocinesis incompletas, origin\u00e1ndose varias c\u00e9lulas multinucleadas de gran tama\u00f1o denominadas c\u00e9lulas gigantes (cgs). Estas poseen numerosas invaginaciones de la pared celular adyacente al xilema, un citoplasma denso con un ret\u00edculo endoplasm\u00e1tico muy desarrollado, y gran cantidad de org\u00e1nulos como mitocondrias, ribosomas y pro-plastidios. Los importantes cambios metab\u00f3licos y fisiol\u00f3gicos necesarios para poder formar estas c\u00e9lulas especializadas transcurren a trav\u00e9s de un importante proceso de reprogramaci\u00f3n g\u00e9nica de las c\u00e9lulas precursoras. El inicio del proceso de diferenciaci\u00f3n de estas cgs parece que viene marcado por mol\u00e9culas efectoras secretadas por el nematodo a las c\u00e9lulas precursoras mediante el estilete, pero los mecanismos moleculares implicados en la formaci\u00f3n de estas estructuras celulares al servicio de la nutrici\u00f3n del nematodo, denominadas sitios de alimentaci\u00f3n (nematode feeding sites, nfss) son a\u00fan desconocidos en gran medida. debido a que los medios de control de nematodos qu\u00edmicos y f\u00edsicos m\u00e1s utilizados en agricultura no son totalmente efectivos, o est\u00e1n prohibidos o en fase de prohibici\u00f3n en la uni\u00f3n europea, el control mediante herramientas biotecnol\u00f3gicas basadas en plantas resistentes o tolerantes a nematodos se plantea como una opci\u00f3n necesaria. Una de estas estrategias pretende interferir directamente con el desarrollo de los nematodos, o con la formaci\u00f3n de los sitios de alimentaci\u00f3n, bien mediante la expresi\u00f3n de prote\u00ednas citot\u00f3xicas, o mediante el bloqueo de genes esenciales para el desarrollo de los mismos. En cualquier caso, la expresi\u00f3n del transg\u00e9n deber\u00eda estar lo m\u00e1s restringida posible a los sitios de alimentaci\u00f3n. Para ello, se requiere el estudio pormenorizado de las regiones reguladoras de los genes (promotores), mediante el an\u00e1lisis de la activaci\u00f3n de estos promotores en los nfss y su posible disecci\u00f3n y ulterior modificaci\u00f3n, con el objetivo de aumentar su especificidad. por este motivo, uno de los principales objetivos de esta tesis doctoral ha sido la identificaci\u00f3n de promotores que se induzcan de forma espec\u00edfica en los sitios de alimentaci\u00f3n y que presenten un patr\u00f3n de expresi\u00f3n lo m\u00e1s limitado posible en el resto de los tejidos de la planta y a lo largo de su desarrollo, de forma que pudieran ser utilizados mediante estrategias biotecnol\u00f3gicas para el control de nematodos. Por ello, hemos analizado por una parte promotores de ii genes de la planta y por otra, de genes ajenos a esta, que podr\u00edan tener un patr\u00f3n de expresi\u00f3n algo m\u00e1s restringido. se ha completado el estudio del promotor del gen de choque t\u00e9rmico hahsp17.7g4. En plantas transg\u00e9nicas de tabaco, se hab\u00eda identificado una regi\u00f3n m\u00ednima de 83pb que era suficiente para conferir actividad del promotor espec\u00edficamente en cgs inducidas por m. Javanica y que manten\u00eda su actividad en respuesta a choque t\u00e9rmico y durante embriog\u00e9nesis cig\u00f3tica. En este trabajo hemos comprobado que esta versi\u00f3n corta del promotor de choque t\u00e9rmico (-83 hahsp17.7g4) mantiene su actividad en cgs de arabidopsis, as\u00ed como despu\u00e9s de choque t\u00e9rmico, pero no en embriog\u00e9nesis tard\u00eda. Adicionalmente, mediante el an\u00e1lisis de la inducci\u00f3n del promotor g4 tras la infecci\u00f3n con globodera tabacum pudimos concluir que el promotor se induce espec\u00edficamente por nematodos formadores de agallas, pero no de quistes. Se ha podido, por tanto, comprobar que la inducci\u00f3n de una versi\u00f3n m\u00ednima del promotor que contiene un elemento hse (heat-shock element) de respuesta a nematodos de forma muy espec\u00edfica en cgs se conserva en diferentes especies de plantas, lo que podr\u00eda resultar de gran utilidad para una posible aplicaci\u00f3n biotecnol\u00f3gica, aunque restringida a los nematodos formadores de agallas. adem\u00e1s, los estudios con otros promotores de genes relacionados con la respuesta a embriog\u00e9nesis tard\u00eda y choque t\u00e9rmico que codifican prote\u00ednas hom\u00f3logas a las codificadas por el gen g4 sugieren que la respuesta a choque t\u00e9rmico est\u00e1 m\u00e1s asociada a la activaci\u00f3n frente a nematodos que la de embriog\u00e9nesis tard\u00eda. Por un lado, el promotor hahsp17.6g1 (g1), que no responde a choque t\u00e9rmico pero s\u00ed en embriog\u00e9nesis tard\u00eda, no se indujo en cgs, mientras que el promotor hahsp18.6g2 (g2), que si se induce por choque t\u00e9rmico, se activ\u00f3 espec\u00edficamente en cgs. Adem\u00e1s, una versi\u00f3n mutada del promotor hahsp17.7g4 (g4mutp) que presenta alta actividad tras choque t\u00e9rmico, pero que tiene afectada su actividad en embriog\u00e9nesis tard\u00eda, se activ\u00f3 en cgs. Las respuestas de los diferentes promotores se correlacionaron con diferentes configuraciones de hses, que podr\u00edan estar implicados en la activaci\u00f3n en cgs, probablemente a trav\u00e9s de factores de transcripci\u00f3n del tipo hsf (heat shock factor). Estos resultados, junto con la comprobaci\u00f3n mediante inmunolocalizaci\u00f3n de que las prote\u00ednas de choque t\u00e9rmico de bajo peso molecular (small heat-shock proteins, shsps) de clase i se acumulan en el interior de cgs de tabaco, apoyan la idea de que las cgs inducidas por el nematodo representan un estado transcripcional muy similar al que se produce por choque t\u00e9rmico en lo que se refiere a este tipo de genes, y sugieren que las shsp podr\u00edan tener un papel relevante en la formaci\u00f3n o mantenimiento de las cgs. tambi\u00e9n hemos analizado la activaci\u00f3n de promotores en sentido del viri\u00f3n del virus del estriado del ma\u00edz (maize streak virus, msv) y del virus del enanismo iii del trigo (wheat dwarf virus, wdv). Mediante el an\u00e1lisis de diferentes l\u00edneas transg\u00e9nicas de tabaco y arabidosis que llevaban una fusi\u00f3n de estos promotores a la regi\u00f3n codificante de la \u00edY-glucuronidasa (gus), se observ\u00f3 que el promotor msv era activado en tejido vascular a\u00e9reo, fundamentalmente en floema de hoja, cotiled\u00f3n y algunas estructuras florales. Sin embargo, en ra\u00edz, la activaci\u00f3n del promotor se restringi\u00f3 a sincitios y a cgs, siendo esta indetectable en el resto de tejidos de la ra\u00edz. Con estos resultados podemos concluir que el promotor de msv es espec\u00edfico de nfss en la ra\u00edz, ya que no se detecta expresi\u00f3n en ning\u00fan otro tejido de este \u00f3rgano. Adem\u00e1s, esta conducta se ha observado en dos especies (tabaco y arabidopsis), as\u00ed como con los dos tipos de nematodos fitoendopar\u00e1sitos m\u00e1s extendidos (formadores de quistes y agallas), lo que supone una importante ventaja, ya que podr\u00eda utilizarse como herramienta com\u00fan para ambos tipos de nematodos y para diferentes especies de plantas. Este estudio sugiere adem\u00e1s que puede existir una cierta similitud entre el o los mecanismos de activaci\u00f3n del ciclo celular de novo en las c\u00e9lulas de la planta mediado por geminivirus con el observado en cgs. para poder llevar a cabo esta estrategia biotecnol\u00f3gica anti-sitios de alimentaci\u00f3n, adem\u00e1s de conseguir un promotor espec\u00edfico, tambi\u00e9n es necesario identificar genes esenciales para el desarrollo y\/o mantenimiento de los nfss, principalmente en los primeros estadios de su desarrollo, de forma que podamos obtener una bater\u00eda de genes candidatos que puedan ser utilizados junto a los promotores espec\u00edficos para bloquear el desarrollo de los nfss. para ello analizamos los cambios globales de expresi\u00f3n g\u00e9nica que se producen durante la diferenciaci\u00f3n de las cgs mediante un estudio del transcriptoma de cgs en estadios tempranos de formaci\u00f3n (3 d\u00edas) frente a tejido vascular control en arabidopsis. Utilizamos de manera combinada la hibridaci\u00f3n de microordenamientos de adn junto con la microdisecci\u00f3n de gcs por laser. Gracias a esta combinaci\u00f3n t\u00e9cnica, se han podido identificar 1161 genes diferencialmente expresados en cgs, de los que 851 mostraron menores niveles transcripcionales que el control, lo que indica que posiblemente ocurran mecanismos de represi\u00f3n g\u00e9nica en estadios tempranos del desarrollo de cgs que permitan su diferenciaci\u00f3n en un tipo celular \u00fanico. Mi principal contribuci\u00f3n a este trabajo ha sido la hibridaci\u00f3n en microordenamientos de adn, arn aislado de agallas diseccionadas a mano 3 d\u00edas post-infecci\u00f3n, frente a segmentos equivalentes de ra\u00edces control en el mismo estadio de crecimiento, gracias a lo que se pudo realizar la comparaci\u00f3n del transcriptoma diferencial de cgs microdiseccionadas por l\u00e1ser con el de agallas diseccionadas a mano. De los 547 genes diferencialmente expresados en agallas frente a los segmentos de ra\u00edz control, solo 120 coinciden con los identificados en el transcriptoma diferencial de cgs, lo que confirma la diluci\u00f3n de los tr\u00e1nscritos de cgs en muestras de arn de agallas. La clasificaci\u00f3n de los genes exclusivos de cgs (que no se encuentran iv diferencialmente expresados en agallas) y genes distintivos de agallas (que no est\u00e1n diferencialmente expresados en cgs) en categor\u00edas funcionales nos ha permitido identificar procesos caracter\u00edsticos de cgs, lo que indica la identidad molecular particular de estas c\u00e9lulas en relaci\u00f3n a sus patrones de expresi\u00f3n g\u00e9nica en comparaci\u00f3n con el resto de tejidos de la agalla. En general, los genes relativos a la modificaci\u00f3n de pared son co-regulados en cgs y agallas. Por el contrario, genes relacionados con el metabolismo secundario, como los implicados en defensa o en s\u00edntesis de ligninas son reprimidos en cgs e inducidos en agallas. Un dato de alto inter\u00e9s es que solo 8 de los 100 genes diferencialmente expresados en cgs que codifican factores de transcripci\u00f3n se regulan de modo similar en agallas, lo que sugiere que las cascadas de transducci\u00f3n de se\u00f1ales que llevan a la formaci\u00f3n de las gcs y del resto de los tejidos hipertrofiados de las agallas, son muy diferentes. por \u00faltimo, hemos identificado un grupo de genes exclusivos de cgs en sus primeras etapas de desarrollo. Estos genes regulados de modo caracter\u00edstico, junto con promotores g\u00e9nicos espec\u00edficos del sitio de alimentaci\u00f3n, podr\u00edan ser utilizados en estrategias biotecnol\u00f3gicas, expres\u00e1ndolos o reprimi\u00e9ndolos en las c\u00e9lulas gigantes en plantas de inter\u00e9s agr\u00edcola para interferir en la formaci\u00f3n de los nfss. Estudios posteriores confirmar\u00e1n su posible eficacia en este control.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudio de la regulacion de genes en celulas de alimentacion de nematodos endoparasitos sedentarios para su futuro empleo como herramientas biotecnologicas de control<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudio de la regulacion de genes en celulas de alimentacion de nematodos endoparasitos sedentarios para su futuro empleo como herramientas biotecnologicas de control <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Alejandra Garcia Ruiz <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Castilla-la mancha<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 28\/07\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Carolina Escobar Lucas<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: alfonso g. Navas sanchez <\/li>\n<li>pilar Cubas dominguez (vocal)<\/li>\n<li>gregorio Hueros soto (vocal)<\/li>\n<li>monta\u00f1a Mena marugan (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Alejandra Garcia Ruiz Los nematodos endopar\u00e1sitos sedentarios de plantas producen importantes p\u00e9rdidas econ\u00f3micas en la agricultura. 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