{"id":103530,"date":"2010-09-09T00:00:00","date_gmt":"2010-09-09T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/silenciamiento-genico-en-mucor-circinelloides-analisis-estructural-y-funcional-del-gen-dicer-2\/"},"modified":"2010-09-09T00:00:00","modified_gmt":"2010-09-09T00:00:00","slug":"silenciamiento-genico-en-mucor-circinelloides-analisis-estructural-y-funcional-del-gen-dicer-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/acidos-nucleicos\/silenciamiento-genico-en-mucor-circinelloides-analisis-estructural-y-funcional-del-gen-dicer-2\/","title":{"rendered":"Silenciamiento g\u00e9nico en mucor circinelloides: an\u00e1lisis estructural y funcional del gen dicer-2"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Juan  Pedro De Haro Hernandez <\/strong><\/h2>\n<p>El silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna (rna silencing) act\u00faa mediante mecanismos transcripcionales y postranscripcionales para suprimir, de forma espec\u00edfica, la expresi\u00f3n g\u00e9nica de los genes diana. En eucariotas superiores, este mecanismo est\u00e1 implicado en una amplia variedad de procesos biol\u00f3gicos, incluyendo la defensa frente a virus, transposones y transgenes, la regulaci\u00f3n de la expresi\u00f3n g\u00e9nica y la formaci\u00f3n de la heterocromatina. El control de estos procesos est\u00e1 mediado por peque\u00f1as mol\u00e9culas de rna, los sirnas y mirnas, que son generados a partir de precursores de rna de doble cadena (dsrna) por la enzima dicer. Estos peque\u00f1os rnas son incorporados en complejos multiproteicos donde sirven de gu\u00eda para identificar mol\u00e9culas de rna con secuencias complementarias, provocando la inhibici\u00f3n de su transcripci\u00f3n, el bloqueo de su traducci\u00f3n o su degradaci\u00f3n.  en el hongo cigomiceto mucor circinelloides, la introducci\u00f3n de copias ex\u00f3genas del gen carb, utilizado como chivato del silenciamiento, conduce a la supresi\u00f3n de la expresi\u00f3n de dicho gen por degradaci\u00f3n de su mrna. Los transformantes silenciados acumulan mol\u00e9culas de sirna, con sentido y antisentido, correspondientes a secuencias del gen carb. Se han identificado dos clases distintas de sirnas antisentido en m. Circinelloides, de 21-nt y 25-nt, que se acumulan diferencialmente durante el crecimiento vegetativo de los transformantes silenciados. La disrupci\u00f3n del gen dicer1 de m. Circinelloides no impide la formaci\u00f3n de sirnas en los mutantes dicer1- silenciados. Estos mutantes acumulan los dos tipos de sirnas, de 21 y 25-nt, que se generan cuando se induce el silenciamiento en la estirpe silvestre. Ya que las enzimas dicer son responsables de producir estos sirnas gracias a su actividad rnasaiii, deb\u00eda existir otro gen que codifique una prote\u00edna dicer capaz de  generar los sirnas en los mutantes dicer1-.  utilizando oligonucle\u00f3tidos degenerados dise\u00f1ados a partir de la secuencia de uno de los genes dicer de rhizopus oryzae, un cigomiceto muy pr\u00f3ximo filogen\u00e9ticamente a m. Circinelloides, se consigui\u00f3 clonar un fragmento del gen dicer2 de este hongo. El rastreo de una genoteca gen\u00f3mica de m. Circinelloides con el fragmento amplificado permiti\u00f3 aislar el gen dicer2 completo y las regiones gen\u00f3micas adyacentes. Una vez obtenida la secuencia completa del gen se desarrollaron las estrategias conducentes a su caracterizaci\u00f3n estructural. Mediante experimentos de rt-pcr se pudo determinar la secuencia de poliadenilaci\u00f3n y la presencia de cuatro intrones en la secuencia del gen. La prote\u00edna dicer-2 que derivar\u00eda de la secuencia deducida para el gen dicer2 tendr\u00eda un tama\u00f1o de 1608 amino\u00e1cidos y contendr\u00eda todos los dominios estructurales normalmente encontrados en las prote\u00ednas dicer conocidas: un dominio dexdc, un dominio helicasa helicc, un dominio duf283 de uni\u00f3n a rna de doble cadena, un dominio paz, dos dominios rnasaiii y un dominio dsrm (motivo de uni\u00f3n a rna de doble cadena). para completar la caracterizaci\u00f3n del gen dicer2 se estudi\u00f3 su expresi\u00f3n durante el crecimiento vegetativo de m.Circinelloides mediante un an\u00e1lisis de northern. La comparaci\u00f3n de los niveles de expresi\u00f3n del gen dicer2 en individuos silvestres en los que se indujo el silenciamiento del gen carb y en individuos en los que no se llev\u00f3 a cabo esta inducci\u00f3n no revel\u00f3 diferencias significativas en cuanto a la expresi\u00f3n de dicho gen en una u otra situaci\u00f3n. Este hecho difiere respecto a lo observado en otros organismos, en los que la activaci\u00f3n del mecanismo de silenciamiento se asocia a un incremento en los niveles de expresi\u00f3n de los genes implicados en este proceso. para llevar a cabo el an\u00e1lisis funcional del gen dicer2 se obtuvo una estirpe mutante dicer2- mediante disrupci\u00f3n g\u00e9nica. Con el fin de determinar si el mutante dicer2- estaba afectado en la ruta de silenciamiento, se transform\u00f3 con un pl\u00e1smido que contiene una repetici\u00f3n invertida correspondiente a una regi\u00f3n del gen carb. El procesamiento del rna generado a partir de esta construcci\u00f3n da lugar a una horquilla de dsrna capaz de inducir altas frecuencias de silenciamiento en la estirpe silvestre. Los resultados de la transformaci\u00f3n del mutante dicer2- y de la estirpe silvestre revelaron  una frecuencia de silenciamiento muy baja en el mutante (5% frente al 84,8 % del silvestre). Sin embargo, la ausencia de prote\u00edna dicer-2 parece poder ser compensada en cierta medida por la enzima dicer-1, indicando una redundancia parcial de ambos genes. Adem\u00e1s, la producci\u00f3n de los dos tipos de sirnas contin\u00faa a\u00fan en ausencia de la prote\u00edna dicer-2, aunque con muy baja eficacia. Para descartar la existencia de una actividad dicer adicional que explicase la redundancia observada se gener\u00f3 un doble mutante dicer1- dicer2-. Los experimentos de transformaci\u00f3n revelaron que esta estirpe es incapaz de llevar a cabo el silenciamiento inducido por transgenes.  tras comprobar que es la enzima dicer-2 la que juega el papel principal en el mecanismo de silenciamiento, se llev\u00f3 a cabo la expresi\u00f3n de un fragmento con los dos dominios rnasaiii en escherichia coli y de la prote\u00edna completa en un sistema de c\u00e9lulas de insecto. Los ensayos enzim\u00e1ticos realizados con las dos prote\u00ednas obtenidas no dieron resultados positivos, probablemente por problemas relacionados con el plegamiento de las prote\u00ednas en sistemas heter\u00f3logos. en hongos filamentosos existen muy pocos datos acerca de las posibles funciones end\u00f3genas del mecanismo de silenciamiento. Para avanzar en el conocimiento de estas funciones, hemos clonado, secuenciado y caracterizado la poblaci\u00f3n de peque\u00f1os rnas (srnas) acumulados end\u00f3genamente en m. Circinelloides, tanto en la estirpe silvestre como en los mutantes dicer1- y dicer2-. La utilizaci\u00f3n de m\u00e9todos de secuenciaci\u00f3n masiva y la comparaci\u00f3n de las secuencias obtenidas con la secuencia gen\u00f3mica del hongo, recientemente desentra\u00f1ada, nos ha permitido determinar el alto nivel de transcripci\u00f3n del genoma de mucor, as\u00ed como la presencia de un elevado n\u00famero de srnas correspondientes tanto a secuencias repetidas y transposones, como a genes codificadores de prote\u00ednas. La comparaci\u00f3n de los perfiles gen\u00f3micos de los srnas acumulados en la estirpe silvestre y en los distintos mutantes de silenciamiento nos ha permitido, adem\u00e1s, determinar la ruta de silenciamiento que ha generado cada uno de los srnas y sus caracter\u00edsticas m\u00e1s destacables. Los resultados obtenidos en el an\u00e1lisis gen\u00f3mico y bioinform\u00e1tico de los srnas han sido validados mediante experimentos de northern, que confirman la participaci\u00f3n de la maquinaria de silenciamiento en la generaci\u00f3n de estos srnas end\u00f3genos. A pesar de la redundancia existente entre los dos genes dicer de m. Circinelloides, los resultados indican que la enzima dicer2 es la principal responsable de generar los srnas end\u00f3genos en este organismo, existiendo un reducido n\u00famero de loci para los que la biog\u00e9nesis de los srnas depende principalmente de dicer1. As\u00ed, ambas enzimas mantienen la misma jerarqu\u00eda que en la ruta de silenciamiento inducida por la introducci\u00f3n de transgenes donde dicer2 juega el papel principal.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Silenciamiento g\u00e9nico en mucor circinelloides: an\u00e1lisis estructural y funcional del gen dicer-2<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Silenciamiento g\u00e9nico en mucor circinelloides: an\u00e1lisis estructural y funcional del gen dicer-2 <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Juan  Pedro De Haro Hernandez <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Murcia<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 09\/09\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Rosa Mar\u00eda Ruiz Vazquez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Francisco Garc\u00eda carmona <\/li>\n<li>Jos\u00e9 Mar\u00eda D\u00edaz m\u00ednguez (vocal)<\/li>\n<li>Carlos Garc\u00eda estrada (vocal)<\/li>\n<li>Javier Avalos cordero (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Juan Pedro De Haro Hernandez El silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna (rna silencing) act\u00faa mediante mecanismos transcripcionales 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