{"id":104261,"date":"2018-03-11T10:27:07","date_gmt":"2018-03-11T10:27:07","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/monitorizacion-optica-de-la-liberacion-de-vesa%c2%adculas-sinapticas-unicas-en-neuronas-de-hipocampo-en-cultivo\/"},"modified":"2018-03-11T10:27:07","modified_gmt":"2018-03-11T10:27:07","slug":"monitorizacion-optica-de-la-liberacion-de-vesa%c2%adculas-sinapticas-unicas-en-neuronas-de-hipocampo-en-cultivo","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sevilla\/monitorizacion-optica-de-la-liberacion-de-vesa%c2%adculas-sinapticas-unicas-en-neuronas-de-hipocampo-en-cultivo\/","title":{"rendered":"Monitorizaci\u00f3n \u00f3ptica de la liberaci\u00f3n de ves\u00edculas sin\u00e1pticas \u00fanicas en neuronas de hipocampo en cultivo"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> M\u00aaangeles Montes Fern\u00e1ndez <\/strong><\/h2>\n<p>Introducci\u00f3n: la transmisi\u00f3n sin\u00e1ptica se define como la transferencia de informaci\u00f3n entre c\u00e9lulas nerviosas. Este es el proceso m\u00e1s importante que tiene lugar en el cerebro. El procesamiento de la informaci\u00f3n neuronal requiere de unos mecanismos de se\u00f1alizaci\u00f3n que deben de ser flexibles y f\u00e1cilmente modificables. Este proceso de comunicaci\u00f3n neuronal requiere de sitios especializados donde se va a producir la transmisi\u00f3n sin\u00e1ptica que se denomina sinapsis. la se\u00f1alizaci\u00f3n sin\u00e1ptica est\u00e1 mediada por una gran variedad de neurotransmisores qu\u00edmicos que llevan una se\u00f1al desde una neurona presin\u00e1ptica a una neurona postsin\u00e1ptica. Independientemente del tipo de neurotransmisor el mismo  mecanismo es utilizado en todas las sinapsis. El neurotransmisor es almacenado en las ves\u00edculas sin\u00e1pticas en el terminal presin\u00e1ptico y es liberado cuando se produce la llegada de un potencial de acci\u00f3n. El neurotransmisor liberado va a estimular a los receptores postsin\u00e1pticos y as\u00ed se completa la transmisi\u00f3n sin\u00e1ptica. La mayor\u00eda de las neuronas forman m\u00e1s de 500 terminales nerviosos presin\u00e1pticos que est\u00e1n ampliamente separados de los cuerpos celulares neuronales. El potencial de acci\u00f3n se inicia en el cuerpo celular viaja hacia el terminal nervioso para ser transformado en la se\u00f1al secretora sin\u00e1ptica. No todos los potenciales de acci\u00f3n se convierten en una se\u00f1al secretora (ygoda &#038; sudhof, 1997). En la mayor\u00eda de los terminales s\u00f3lo 10%-20% de los potenciales de acci\u00f3n producen la liberaci\u00f3n.  seg\u00fan la hip\u00f3tesis de del castillo y katz en 1954 de c\u00f3mo se produce la transmisi\u00f3n sin\u00e1ptica debemos de considerar el mecanismo por el que se liberan las sustancias transmisoras. A pesar de que la liberaci\u00f3n del transmisor sin\u00e1ptico parece uniformemente graduada realmente el transmisor se libera en cantidades discretas denominadas cuantos. Cada cuanto de transmisor produce un potencial sin\u00e1ptico de tama\u00f1o fijo denominado potencial sin\u00e1ptico cu\u00e1ntico. El potencial postsin\u00e1ptico total est\u00e1 constituido por un n\u00famero integral de respuestas cu\u00e1nticas. Los potenciales sin\u00e1pticos aparecen como una escala uniformemente graduada en los registros porque cada potencial cu\u00e1ntico es demasiado peque\u00f1o en relaci\u00f3n con el potencial total.   figura 1. Imagen tomada del art\u00edculo (del castillo &#038; katz, 1954). A. Fluctuaciones del potencial de placa motora de la uni\u00f3n neuromuscular. B. Histogramas que muestran la distribuci\u00f3n de amplitudes de los potenciales espont\u00e1neos en miniatura y los potenciales de la placa motora. al realizar una correlaci\u00f3n morfol\u00f3gica de las variables definidas por katz en el sistema nervioso central podemos deducir:  a)\tcuanto: es la exocitosis de una \u00fanica ves\u00edcula sin\u00e1ptica. b)\tsitios de liberaci\u00f3n (n): una zona activa: el n\u00famero de lugares de liberaci\u00f3n (n) se corresponde con el n\u00famero de ves\u00edculas dispuestas para liberarse o bien el n\u00famero de sitios de membrana espec\u00edficos que podr\u00eda exocitarse tras la llegada de un potencial de acci\u00f3n. Varios autores han descrito que el n\u00famero de lugares de liberaci\u00f3n es muy similar al n\u00famero de sinapsis (zucker, 1973), (redman, 1990) y (korn &#038; faber, 1991). Esta observaci\u00f3n nos lleva a la conclusi\u00f3n de que existen algunos mecanismos que restringen el n\u00famero de ves\u00edculas que se van a fusionar por impulso nervioso en un \u00fanico terminal. Algunas conexiones sin\u00e1pticas poseen un gran n\u00famero de zonas activas pero en la mayor\u00eda de las sinapsis s\u00f3lo nos encontramos con una \u00fanica zona activa. As\u00ed se sabe que en las neuronas en cultivo 11 de 16 (69%) botones poseen una \u00fanica zona activa y 5 (31%) botones poseen dos zonas activas (schikorski &#038; stevens, 1997)   figura 2. Imagen tomada del art\u00edculo (schikorski &#038; stevens, 1997). A, microscop\u00eda electr\u00f3nica de varias sinapsis del estratum radiatum en ca1 en el hipocampo del rat\u00f3n donde las flechas indican los bordes de las zonas activas. B y c microscop\u00eda electr\u00f3nica donde se muestra la ultraestructura de dos sinapsis de neuronas de hipocampo crecidas en cultivo. c)\tprobabilidad de liberaci\u00f3n (p): es la probabilidad que un cuanto pueda ser liberado cuando llega un impulso nervioso. En la mayor\u00eda de las sinapsis en el cerebro poseen un valor peque\u00f1o y es variable incluso en las sinapsis presentes en un mismo ax\u00f3n (hessler et al., 1993), (rosenmund et al., 1993), (allen &#038; stevens, 1994) y (murthy et al., 1997). La mayor\u00eda de las sinapsis poseen una probabilidad de liberaci\u00f3n ~0.3 pero algunas sinapsis espec\u00edficas poseen valores que oscilan entre 0.05 y 0.9 o m\u00e1s. Al incrementar la concentraci\u00f3n de calcio extracelular se puede observar un incremento en la probabilidad de liberaci\u00f3n (murthy et al., 1997). la probabilidad de liberaci\u00f3n va a estar regulado por el tama\u00f1o del contingente de ves\u00edculas que est\u00e1n listas para ser liberadas  (rrp) es decir est\u00e1 regulado por el n\u00famero de ves\u00edculas ancladas en la membrana (zucker, 1973). El n\u00famero de ves\u00edculas por bot\u00f3n es de 195 con un rango que oscila entre 23 y 648 ves\u00edculas y el n\u00famero de ves\u00edculas que forman parte del rrp es de 5-10 ves\u00edculas (harris &#038; sultan, 1995) y (schikorski &#038; stevens, 1997).  as\u00ed podemos definir  el rrp como la poblaci\u00f3n de neurotransmisor que est\u00e1 inmediatamente disponible para ser liberado cuando se aplica una estimulaci\u00f3n a alta frecuencia. El rrp va a definir la probabilidad de liberaci\u00f3n. Adem\u00e1s se ha propuesto que este contingente coincide con las ves\u00edculas que se encuentran ancladas en la membrana (schikorski &#038; stevens, 2001). El tama\u00f1o del rrp ha sido estimado utilizando una soluci\u00f3n hipert\u00f3nica (stevens &#038; tsujimoto, 1995) o bien utilizando una estimulaci\u00f3n de 40 potenciales de acci\u00f3n a 20 hz en experimentos que utilizan t\u00e9cnicas de imagen como es el marcaje de las ves\u00edculas sin\u00e1pticas utilizando los colorantes fm (schikorski &#038; stevens, 2001). objetivos: los objetivos de esta tesis son: 1.\tExpresi\u00f3n en membrana plasm\u00e1tica de neuronas de hipocampo de prote\u00ednas de las ves\u00edculas sin\u00e1pticas fluorescentes unidas a sensores de ph como la sinaptobrevina-fluorina y sinaptofisina-fluorina.  2.\tEstudio de la amplitud de la intensidad de fluorescencia de las neuronas de hipocampo utilizando un sistema de microestimulaci\u00f3n donde inyectamos cantidades peque\u00f1as de corriente de una magnitud de 50 \u00c2\u00b5a  y provocamos el disparo de distinto n\u00famero de potenciales de acci\u00f3n. 3.\tEstudio de las constantes cin\u00e9ticas de exocitosis y endocitosis de la respuesta de distintos tipos de estimulaci\u00f3n. 4.\tDetecci\u00f3n \u00f3ptica de la se\u00f1al de fluorescencia de la respuesta con un \u00fanico potencial de acci\u00f3n. 5.\tEstudiar la respuesta con un \u00fanico potencial para comprobar si la liberaci\u00f3n se debe a ves\u00edculas \u00fanicas o no. 6.\tAjuste de esta respuesta a una distribuci\u00f3n binomial. 7.\tEstudio de colocalizaci\u00f3n de los botones sin\u00e1pticos utilizando un sistema adaptado a la c\u00e1mara (dualview) que nos permite separar la se\u00f1al de fluorescencia en verde y en rojo. 8.\tEstudio de la respuesta de los mismos botones te\u00f1idos con colorantes de membrana como son fm y botones transfectados con prote\u00ednas fluorescentes sensibles a ph.  material y m\u00e9todos: para ello se van a utilizar neuronas de hipocampo de rata crecidas sobre una monocapa de astrocitos. Estas neuronas se van a transfectar con el m\u00e9todo de fosfato c\u00e1lcico.  los pl\u00e1smidos utilizados para la transfecci\u00f3n van a ser sinaptobrevina-fluorina y sinaptofisina-fluorina. La estructura de estos pl\u00e1smidos se muestra en la siguiente figura: sinaptobrevina-fluorina    sinaptofisina-fluorina         otra t\u00e9cnica utilizada para estudiar el reciclaje de las ves\u00edculas sin\u00e1pticas va a ser la tinci\u00f3n con colorantes fm. El fm 4-64 y otros colorantes estiril han sido utilizados para monitorizar la exocitosis, endocitosis y  el tr\u00e1fico endosomal de una gran variedad de tipos celulares. Este colorante es una mol\u00e9cula anfip\u00e1tica y su estructura est\u00e1 formada por una cabeza cargada y una cola anfip\u00e1tica. La fluorescencia de las mol\u00e9culas de fm reside en la  regi\u00f3n central de uni\u00f3n entre la cabeza polar y la cola anfip\u00e1tica. El n\u00famero y longitud de estas colas hidrof\u00f3bicas va a determinar la cin\u00e9tica de lavado de los diferentes tipos de fm (betz et al., 1996).  Este colorante tiene la propiedad de emitir fluorescencia cuando est\u00e1 en contacto con las membranas.     \t n-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl) pyridinium dibromide (fm\u00c2\u00ae 4-64)  bibliograf\u00eda: allen c &#038; stevens cf. (1994). An evaluation of causes for unreliability of synaptic transmission. Proc natl acad sci u s a 91, 10380-10383. betz wj, mao f &#038; smith cb. (1996). Imaging exocytosis and endocytosis. Curr opin neurobiol 6, 365-371. del castillo j &#038; katz b. (1954). Quantal components of the end-plate potential. J physiol 124, 560-573. goda y &#038; sudhof tc. (1997). Calcium regulation of neurotransmitter release: reliably unreliable? Curr opin cell biol 9, 513-518. harris km &#038; sultan p. (1995). Variation in the number, location and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal ca1 synapses. Neuropharmacology 34, 1387-1395. hessler na, shirke am &#038; malinow r. (1993). The probability of transmitter release at a mammalian central synapse. Nature 366, 569-572. korn h &#038; faber ds. (1991). Quantal analysis and synaptic efficacy in the cns. Trends neurosci 14, 439-445. murthy vn, sejnowski tj &#038; stevens cf. (1997). Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron 18, 599-612. redman s. (1990). Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiol rev 70, 165-198. rosenmund c, clements jd &#038; westbrook gl. (1993). Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science 262, 754-757. schikorski t &#038; stevens cf. (1997). Quantitative ultrastructural analysis of hippocampal excitatory synapses. J neurosci 17, 5858-5867.  schikorski t &#038; stevens cf. (2001). Morphological correlates of functionally defined synaptic vesicle populations. Nat neurosci 4, 391-395. stevens cf &#038; tsujimoto t. (1995). Estimates for the pool size of releasable quanta at a single central synapse and for the time required to refill the pool. Proc natl acad sci u s a 92, 846-849. zucker rs. (1973). Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J physiol 229, 787-810.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Monitorizaci\u00f3n \u00f3ptica de la liberaci\u00f3n de ves\u00edculas sin\u00e1pticas \u00fanicas en neuronas de hipocampo en cultivo<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Monitorizaci\u00f3n \u00f3ptica de la liberaci\u00f3n de ves\u00edculas sin\u00e1pticas \u00fanicas en neuronas de hipocampo en cultivo <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 M\u00aaangeles Montes Fern\u00e1ndez <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Sevilla<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 15\/10\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Guillermo Alvarez De Toledo Naranjo<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: carles Solsona sancho <\/li>\n<li>ricardo Borges jurado (vocal)<\/li>\n<li>bernat Soria escoms (vocal)<\/li>\n<li>luc\u00eda Tabares (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de M\u00aaangeles Montes Fern\u00e1ndez Introducci\u00f3n: la transmisi\u00f3n sin\u00e1ptica se define como la transferencia de informaci\u00f3n entre c\u00e9lulas nerviosas. 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