{"id":104566,"date":"2018-03-11T10:27:39","date_gmt":"2018-03-11T10:27:39","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/polimerasas-de-rna-y-su-papel-en-el-silenciamiento-genico-mediado-por-rna-en-mucor-circinelloides\/"},"modified":"2018-03-11T10:27:39","modified_gmt":"2018-03-11T10:27:39","slug":"polimerasas-de-rna-y-su-papel-en-el-silenciamiento-genico-mediado-por-rna-en-mucor-circinelloides","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/micologia\/polimerasas-de-rna-y-su-papel-en-el-silenciamiento-genico-mediado-por-rna-en-mucor-circinelloides\/","title":{"rendered":"Polimerasas de rna y su papel en el silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna en mucor circinelloides"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Silvia Calo Varela <\/strong><\/h2>\n<p>El silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna (rna silencing) act\u00faa mediante mecanismos transcripcionales y postranscripcionales para suprimir, de forma espec\u00edfica, la expresi\u00f3n g\u00e9nica de genes diana. En eucariotas superiores, este mecanismo est\u00e1 implicado en una amplia variedad de procesos biol\u00f3gicos, incluyendo la defensa frente a virus, transposones y transgenes, la regulaci\u00f3n de la expresi\u00f3n g\u00e9nica y la formaci\u00f3n de la heterocromatina. El control de estos procesos est\u00e1 mediado por peque\u00f1as mol\u00e9culas de rna, sirnas o mirnas, que son generados por la enzima dicer a partir de precursores de rna de doble cadena (dsrna). Los peque\u00f1os rnas son incorporados en complejos multiproteicos, donde sirven de gu\u00eda para identificar mol\u00e9culas de rna con secuencias complementarias, provocando la inhibici\u00f3n de su transcripci\u00f3n, el bloqueo de su traducci\u00f3n o su degradaci\u00f3n. Las mol\u00e9culas de dsrna que activan el mecanismo pueden ser originadas por complementariedad interna o por la actuaci\u00f3n de una polimerasa de rna dependiente de rna (rdrp). Adem\u00e1s, peque\u00f1as cantidades de la mol\u00e9cula inductora son capaces de activar eficazmente la maquinaria de silenciamiento debido a la existencia de un proceso de amplificaci\u00f3n, llevado a cabo por otra enzima rdrp, que genera nuevas mol\u00e9culas de dsrna utilizando como molde el mrna diana, realimentando as\u00ed el mecanismo. en el hongo zigomiceto mucor circinelloides, la introducci\u00f3n de transgenes ex\u00f3geno del gen carb, utilizado como chivato del silenciamiento, conduce a la supresi\u00f3n de la expresi\u00f3n de dicho gen por degradaci\u00f3n de su mrna. Los transformantes silenciados acumulan mol\u00e9culas de sirna, con sentido (25 nt) y antisentido (21 y 25 nt), correspondientes a secuencias del gen carb. Sin embargo, no se hab\u00eda demostrado si el mecanismo de silenciamiento identificado en m. Circinelloides era un mecanismo can\u00f3nico activado por mol\u00e9culas de dsrna. Gracias al dise\u00f1o de transgenes con \u00c2\u00bfrepeticiones invertidas\u00c2\u00bf del gen carb, capaces de producir, tras su transcripci\u00f3n, una horquilla de rna, se comprob\u00f3 que, efectivamente, el silenciamiento g\u00e9nico en m. Circinelloides sigue un mecanismo can\u00f3nico, actuando el dsrna como activador del mecanismo de una forma m\u00e1s eficaz que los transgenes \u00c2\u00bfcon sentido\u00c2\u00bf, y siendo m\u00e1s estables los transformantes silenciados con este tipo de mol\u00e9culas. 2 si el dsrna es un intermedio del mecanismo de silenciamiento, debe existir en m. circinelloides al menos una rdrp capaz de sintetizar la cadena complementaria de los transgenes en copia \u00fanica, convirti\u00e9ndolos en dsrna, mol\u00e9cula que activar\u00eda la ruta. utilizando oligonucle\u00f3tidos degenerados, dise\u00f1ados a partir de la secuencia de los genes rdrp de rhizopus oryzae, un zigomiceto muy pr\u00f3ximo filogen\u00e9ticamente a m. Circinelloides, se consigui\u00f3 clonar un fragmento del gen rdrp1 de este hongo. El rastreo de una genoteca gen\u00f3mica de m. Circinelloides con el fragmento amplificado permiti\u00f3 aislar el gen rdrp1 completo y las regiones gen\u00f3micas adyacentes. Una vez obtenida la secuencia completa del gen se llev\u00f3 a cabo su caracterizaci\u00f3n estructural. para realizar el an\u00e1lisis funcional del gen rdrp1 se obtuvo una estirpe mutante rdrp1- mediante disrupci\u00f3n g\u00e9nica. Con el fin de determinar si este mutante estaba afectado en la ruta de silenciamiento, se transform\u00f3 con el pl\u00e1smido que contiene un transgen \u00c2\u00bfcon sentido\u00c2\u00bf (en copia \u00fanica) del gen carb y con el que contiene \u00c2\u00bfrepeticiones invertidas\u00c2\u00bf, produciendo una horquilla de rna del mismo gen por complementariedad interna. Los resultados de la transformaci\u00f3n del mutante rdrp1- y de la estirpe silvestre revelaron la incapacidad del mutante para activar el mecanismo de silenciamiento cuando se utilizaban como inductores transgenes \u00c2\u00bfcon sentido\u00c2\u00bf. Sin embargo, la utilizaci\u00f3n de transgenes con \u00c2\u00bfrepeticiones invertidas\u00c2\u00bf permiti\u00f3 obtener transformantes silenciados, aunque con una eficacia menor que en la estirpe silvestre. esto apunta a un papel fundamental del gen rdrp1 en la inducci\u00f3n del silenciamiento, siendo probablemente la enzima responsable de convertir las mol\u00e9culas de ssrna derivadas de los transgenes \u00c2\u00bfcon sentido\u00c2\u00bf en dsrna. La estabilidad del silenciamiento y la producci\u00f3n de sirnas del gen carb en los transformantes silenciados obtenidos con la horquilla de rna en la estirpe mutante rdrp1- son similares a las de la estirpe silvestre, lo que apoya la hip\u00f3tesis anterior. como el gen rdrp1 no tiene un papel importante en el proceso de amplificaci\u00f3n de la se\u00f1al de silenciamiento, se localiz\u00f3 un segundo gen, el rdrp2, en la secuencia gen\u00f3mica de m. circinelloides que hab\u00eda sido puesta a disposici\u00f3n p\u00fablica en ese momento. Este gen fue sometido a la misma caracterizaci\u00f3n estructural y an\u00e1lisis funcional que en el caso del rdrp1. en este caso se observ\u00f3 una reducci\u00f3n dr\u00e1stica en la eficacia de silenciamiento en la estirpe mutante rdrp2-, tanto si \u00e9ste se induc\u00eda por transgenes \u00c2\u00bfcon sentido\u00c2\u00bf como si se utilizaban transgenes \u00c2\u00bfcon repeticiones invertidas\u00c2\u00bf, adem\u00e1s de una baj\u00edsima estabilidad del silenciamiento en estos transformantes. Esto sugiere que el papel del gen rdrp2 debe ser com\u00fan para ambos tipos de inductores y muy importante para el mantenimiento del mecanismo de silenciamiento, por lo que lo m\u00e1s probable es que est\u00e9 relacionado con el proceso de amplificaci\u00f3n. 3 a continuaci\u00f3n se buscaron nuevos genes implicados en el mecanismo de silenciamiento g\u00e9nico, lo que llev\u00f3 a la identificaci\u00f3n de un gen que cifrar\u00eda una prote\u00edna con dos dominios de uni\u00f3n a dsrna, al que se denomin\u00f3 r2d2. Tras su caracterizaci\u00f3n estructural se llev\u00f3 a cabo, de nuevo, un an\u00e1lisis funcional, estudiando el mecanismo de silenciamiento en el mutante r2d2-. La participaci\u00f3n de este gen en el mecanismo de silenciamiento g\u00e9nico se confirm\u00f3 al observar una disminuci\u00f3n en la frecuencia de silenciamiento del mutante r2d2- con respecto a la estirpe silvestre. Los valores similares obtenidos con los distintos tipos de transgenes sugieren que este gen est\u00e1 implicado en un paso com\u00fan a las distintas mol\u00e9culas inductoras. Al no verse afectado el mutante en la estabilidad del silenciamiento ni en su capacidad de producci\u00f3n de sirnas, probablemente ese paso com\u00fan est\u00e9 relacionado con la activaci\u00f3n del silenciamiento. una gran parte de este trabajo ha estado dedicada a la identificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de dos genes rdrp. Para una mejor comprensi\u00f3n de la funci\u00f3n de las prote\u00ednas rdrp en el mecanismo de silenciamiento, as\u00ed como para conocer el posible papel de estas prote\u00ednas en la regulaci\u00f3n de funciones end\u00f3genas, se procedi\u00f3 a la clonaci\u00f3n, secuenciaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de los peque\u00f1os rnas acumulados end\u00f3genamente en los mutantes para los dos genes rdrp de m. Circinelloides y su comparaci\u00f3n con los que se acumulan en la estirpe silvestre. Datos previos de nuestro laboratorio demuestran que en m. Circinelloides la ruta de silenciamiento can\u00f3nica es capaz de regular funciones end\u00f3genas, adem\u00e1s del silenciar transcritos ex\u00f3genos. esta ruta regula la expresi\u00f3n de genes end\u00f3genos mediante la producci\u00f3n de srnas generados, principalmente, por la enzima dicer2. Gracias al an\u00e1lisis realizado durante esta tesis, se ha revelado tambi\u00e9n la participaci\u00f3n, en este proceso, de las prote\u00ednas rdrp1 y, en menor medida, rdrp2. una proporci\u00f3n importante de srnas derivados de exones identificados en este trabajo son dependientes de las rdrps, pero independientes de dicer, por lo que, al no precisar de un procesamiento por esta endonucleasa, deber\u00edan ser producidos por una ruta diferente al mecanismo de silenciamiento can\u00f3nico. El an\u00e1lisis de esta clase de srna indica que son productos de degradaci\u00f3n, pues tienen polaridad con sentido y muestran una distribuci\u00f3n homog\u00e9nea en el rango de tama\u00f1os secuenciado, sin detectarse un tama\u00f1o mayoritario. Al estudiar los loci de los que preceden estos srnas, se observ\u00f3 que el proceso de degradaci\u00f3n deb\u00eda estar participando activamente en la regulaci\u00f3n de la expresi\u00f3n g\u00e9nica, ya que existe un aumento en la acumulaci\u00f3n de mrna de los genes diana en los mutantes rdrp-. Estos loci diana corresponden a genes que cifran prote\u00ednas metab\u00f3licas, y la mayor\u00eda se expresan a niveles muy elevados. Los resultados obtenidos revelan, por tanto, la existencia de una nueva 4 ruta de degradaci\u00f3n de mrna, que depende de los genes rdrp y que regula la expresi\u00f3n de genes end\u00f3genos.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Polimerasas de rna y su papel en el silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna en mucor circinelloides<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Polimerasas de rna y su papel en el silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna en mucor circinelloides <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Silvia Calo Varela <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Murcia<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 29\/10\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Santiago Torres Mart\u00ednez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: vicente Pall\u00e1s benet <\/li>\n<li>cesar Llave correas (vocal)<\/li>\n<li>monserrat Elias arnanz (vocal)<\/li>\n<li>eduardo Antonio Espeso fernandez (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Silvia Calo Varela El silenciamiento g\u00e9nico mediado por rna (rna silencing) act\u00faa mediante mecanismos transcripcionales y postranscripcionales 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