{"id":105896,"date":"2018-03-11T10:29:38","date_gmt":"2018-03-11T10:29:38","guid":{"rendered":""},"modified":"2018-03-11T10:29:38","modified_gmt":"2018-03-11T10:29:38","slug":"caracterizacion-de-los-receptores-de-gamma-butirolactonas-en-las-especies-productoras-de-tacrolimus-streptomyces-tacrolimicus-y-streptomyces-tsukubaensis-analisis-de-sus-sistemas-de-auto-regulacion","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/leon\/caracterizacion-de-los-receptores-de-gamma-butirolactonas-en-las-especies-productoras-de-tacrolimus-streptomyces-tacrolimicus-y-streptomyces-tsukubaensis-analisis-de-sus-sistemas-de-auto-regulacion\/","title":{"rendered":"Caracterizaci\u00f3n de los receptores de gamma butirolactonas en las especies productoras de tacrolimus streptomyces tacrolimicus y streptomyces tsukubaensis. an\u00e1lisis de sus sistemas de auto-regulaci\u00f3n"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Zahra Salehi Najafabadi <\/strong><\/h2>\n<p>Resumen  caracterizaci\u00f3n del gen receptor de butirolactonas de s. Tacrolimicus y su regi\u00f3n flanqueante el genoma s. Tacrolimicus no est\u00e1 secuenciado, por lo que la b\u00fasqueda y clonaci\u00f3n del gen codificante del receptor de gamma-butirolactonas en este microorganismo es una tarea compleja. El alineamiento de las regiones n-terminales conservadas de los genes de los receptores de gamma butirolactonas en 10 diferentes especies del g\u00e9nero streptomyces presentes en las bases de datos [fara de s. Lavendulae (waki et al., 1997), sngr de s. Natalensis (lee et al., 2005), scbr de s. Coelicolor a3 (2) (takano et al., 2001), bara de s. Virginiae (okamoto et al., 1995), tara de s. Tendae (engel et al., 2001), srra de s. Rochei (arakawa et al., 2007), brp de s. Clavuligerus (santamarta et al., 2005), avar de s. Avemitilis, spbr de s. Pristinaespiralis (folcher et al., 2001), tylp de s. Fradiae (stratigopoulos et al., 2002)] permiti\u00f3 el dise\u00f1o de cebadores degenerados para amplificar dicho gen en s. Tacrolimicus. mediante pcr utilizando los oligonucle\u00f3tidos degenerados y adnt de s. Tacrolimicus como molde se amplific\u00f3 un fragmento de aproximadamente 150-pb que fue clonado en el vector pgem-t easy. La secuenciaci\u00f3n del fragmento amplificado mostr\u00f3 una alta similitud con fragmentos internos de genes que codifican prote\u00ednas receptoras de gamma butirolactonas. Por lo tanto, este fragmento de 150-pb fue utilizado como una sonda para el rastreo de una biblioteca g\u00e9nica para localizar c\u00f3smidos que contuviesen el gen gbr. Mediante este sistema de rastreo se localizaron 3 c\u00f3smidos positivos para el gen gbr, de los cuales se seleccion\u00f3 el c\u00f3smido 12c1 para llevar a cabo la secuenciaci\u00f3n del gen gbr y su regi\u00f3n adyacente. Como resultado se obtuvo un fragmento secuenciado de 8722 pb, en el que se detectaron siete posibles marcos de lectura abierta.  en el an\u00e1lisis de orfs se detectaron: i) un regulador de la transcripci\u00f3n de la familia tetr con un 78% de identidad con un regulador transcripcional tetr de streptomyce griseus; ii) dos subunidades de dihidroxiacetona quinasas, la subunidad 1 con un 84% de identidad y la subunidad 2 con un 75% de identidad con las mismas prote\u00ednas de s. Griseus; iii) una hidrolasa con el 76% de identidad con una hipot\u00e9tica hidrolasa en s. Griseus; iv) el gen gbr que posee un 66% de identidad con el receptor butirolactonas (mmfr) de s. Coelicolor a3 (2); v) una glutamina sintetasa con el 98% de similitud con la glutamina sintetasa de streptomyces sp. Spb74; vi) y una prote\u00edna de membrana con 82% de identidad con s. Pristiaespiralis atcc 25486. control del gen gbr mediante secuencias are  el gen gbr presenta una longitud de 645-pb y codifica una prote\u00edna de 214 amino\u00e1cidos (23,4 kda). El alineamiento de la prote\u00edna gbr con otros receptores gamma butirolactonas [incluida la prote\u00edna cprb de s. Coelicolor a3(2) cuya estructura cristalina ha sido determinada), mostraron una similitud significativa entre ellas, especialmente en los residuos de las h\u00e9lices \u00c2\u00bf3 (segunda h\u00e9lice de una t\u00edpica h\u00e9lice-vuelta-h\u00e9lice) del dominio de uni\u00f3n adn. Adem\u00e1s, el amino\u00e1cido trp131 tambi\u00e9n est\u00e1 bien conservado en la prote\u00edna gbr, que es esencial para la actividad de uni\u00f3n al ligando . para demostrar la actividad autorreguladora de la prote\u00edna gbr sobre su propia expresi\u00f3n, la prote\u00edna gbr se sobre expres\u00f3 y purific\u00f3 como una prote\u00edna de fusi\u00f3n (gst gbr). En este proceso, diferentes modificaciones fueron probadas para obtener la prote\u00edna pura, dentro de las cuales las mejores condiciones observadas fueron: i) 4 g\/l de lb (diluci\u00f3n del medio est\u00e1ndar); ii) 22 \u00c2\u00b0c; iii) 0,3 mm de concentraci\u00f3n final de iptg; iv) 3-4 horas de cultivo. La prote\u00edna de fusi\u00f3n expresada se purific\u00f3 a partir del extracto celular crudo por cromatograf\u00eda de afinidad con glutati\u00f3n sefarosa utilizando un akta fplc (fast protein liquid chromatography) y una columna de 1 ml (gstraptm hp). la regi\u00f3n promotora del gen gbr presenta una secuencia conservada are localizada 338 nucle\u00f3tidos corriente arriba del cod\u00f3n de inicio de la traducci\u00f3n. Fragmentos de diferentes tama\u00f1os de la regi\u00f3n promotora se utilizaron para acotar el motivo are mediante ensayos de retraso en gel (emsa). As\u00ed, el fragmento gbre-5 (36 nt) permiti\u00f3 definir la secuencia aaacatcacgacgactacgttatttt como una secuencia are. efecto del gen gbr en la diferenciaci\u00f3n morfol\u00f3gica y en la producci\u00f3n de metabolitos secundarios con objeto de determinar la funci\u00f3n in vivo del gen gbr en s. Tacrolimicus se llev\u00f3 a cabo la deleci\u00f3n de dicho gen mediante la tecnolog\u00eda redirect. La secuencia de 8722 pb, que se describe en la secci\u00f3n anterior, garantiza que el c\u00f3smido 12c1 posee suficiente espacio a ambos lados del gen gbr para realizar el proceso de deleci\u00f3n (doble recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga). De acuerdo a esta metodolog\u00eda se realiz\u00f3 la sustituci\u00f3n del gen gbr por el gen de resistencia a apramicina y el origen de transferencia (orit) en el c\u00f3smido. Posteriormente el proceso de conjugaci\u00f3n se llev\u00f3 a cabo en base a lo descrito por flett y colaboradores (1997). La complementaci\u00f3n y la duplicaci\u00f3n del gen gbr se realiz\u00f3 utilizando el vector conjugativo integrativo pra neo. a pesar de haber sido descrito con anterioridad que s. Tacrolimicus es una cepa productora de tacrolimus (garrity et al., 1993; yoon y choi y et al., 1997; jung et al., 2009), utilizando el an\u00e1lisis por hplc, no ha sido posible obtener un pico cromatogr\u00e1fico correspondiente a tacrolimus. Por lo que se realizaron bioensayos utilizando la cepa s. Cerevisiae tb23 [sensible a inmunosupresores (arndt et al., 1999)] con caldos de fermentaci\u00f3n concentrados de diferentes cepas de s. Tacrolimicus, en medio de r5. De esta manera se pudieron observar claros halos de inhibici\u00f3n que demostraron la producci\u00f3n de un compuesto con actividad inmunosupresora similar a tacrolimus en s. Tacrolimicus. Mediante el an\u00e1lisis por bioensayo se pudo comprobar que la cepa delecionada en el gen gbr produce mayor cantidad del posible compuesto inmunosupresor comparada con la cepa silvestre. As\u00ed mismo la cepa complementada present\u00f3 una producci\u00f3n de dicho compuesto menor que la cepa mutante (similar a la silvestre). Por ello, se puede concluir que el gen gbr act\u00faa como un inhibidor de la producci\u00f3n de metabolitos secundarios similares a tacrolimus. con el objeto de estudiar el efecto del gen gbr en la diferenciaci\u00f3n morfol\u00f3gica de s. Tacrolimicus, se analizaron las caracter\u00edsticas fenot\u00edpicas de las cepas: silvestre, \u00c2\u00bfgbr, duplicada y complementa en medio s\u00f3lido. Las cepas silvestre y duplicada cultivadas en medio r5 presentaron serias dificultades en la producci\u00f3n de esporas. Por su parte, la cepa mutante \u00c2\u00bfgbr mostr\u00f3 una buena esporulaci\u00f3n. Estas diferencias en la esporulaci\u00f3n se observaron tambi\u00e9n en el medio de tbo. En este medio, el inicio de la esporulaci\u00f3n de la cepa \u00c2\u00bfgbr fue por lo menos un d\u00eda anterior y la cantidad de esporas fue m\u00e1s abundante que en la cepa silvestre. Con respecto a la cepa duplicar la eficiencia de esporulaci\u00f3n fue muy baja. Todos estos cambios en los fenotipos de la cepa mutante \u00c2\u00bfgbr fueron restaurados por la introducci\u00f3n de una copia del gen gbr intacta. caracterizaci\u00f3n de los pl\u00e1smidos presentes en s. Tsukubaensis en contra de lo que suele ocurrir en la mayor\u00eda de eubacterias, la mayor\u00eda de los pl\u00e1smidos y cromosomas presentes en especies del g\u00e9nero streptomyces suelen ser lineales (hayakawa et al., 1979; lin et al., 1993), llegando incluso a albergar hasta tres o cuatro pl\u00e1smidos lineales (kinashi et al., 1994; zhang et al., 2006). el an\u00e1lisis del genoma de s. Tsukubaensis mediante geles en campo pulsante (pfge: pulse field gel electrophoresis) en las condiciones optimizadas (0,8% de agarosa, tamp\u00f3n tbe 0,5x, 150 v durante 24 horas con tiempo de pulso 120 segundos y 36 horas con 240 segundos) mostr\u00f3 que hay dos pl\u00e1smidos lineares gigantes psts-l (1,8 mb) y psts-m (0,9 mb) y un pl\u00e1smido circular psts-s. Estos pl\u00e1smidos circulares presentan problemas de estimaci\u00f3n de su tama\u00f1o, ya que no migran de acuerdo a \u00e9ste, migrando casi como en la electroforesis tradicional (kieser et al., 2000). Por ello, mediante el m\u00e9todo de lisis alcalina, dos pl\u00e1smidos circulares, denominados psts1 y psts2 se extrajeron de s. Tsukubaensis. Los cuales posteriormente fueron localizados en el genoma de s. Tsukubaensis, presentando unos tama\u00f1os de 24.747 pb y 31.070 pb, respectivamente. Lo cual indic\u00f3 que el pl\u00e1smido psts-s son en realidad 2 pl\u00e1smidos circulares de peque\u00f1o tama\u00f1o.  caracterizaci\u00f3n del gen del receptor de -butirolactona de s. Tsukubaensis el microorganismo s. Tsukubaensis es un productor conocido de tacrolimus del cual se est\u00e1 llevando a cabo la secuenciaci\u00f3n de su genoma en inbiotec. Dicho genoma revel\u00f3 muchos genes reguladores de bios\u00edntesis, entre los cuales se ha localizado un grupo de 11 posible genes reguladores [designado como agrupaci\u00f3n tsu (por s. Tsukubaensis)], el cual presenta gran similitud con la agrupaci\u00f3n de genes de gamma butirolactonas en s. Rochei (arakawa et al., 2007).   entre los genes que aparecen en esta regi\u00f3n detectaron: i) dos receptores gamma butirolactonas hom\u00f3logos denominados tsur1 (75% de identidad con el receptor alpz de s. Ambofaciens) y tsur2 (52% de identidad con el receptor srrb s. Rochei), ii) dos gamma butirolactonas sintetasas denominadas tsus1 (47% de identidad con la gamma butirolactona sintetasa barx de streptomyces sp. Mg1) y tsus2 (44% de identidad con la gamma butirolactona sintetasa farx de s. Lavendulae); iii) dos reguladores de la familia sarp (streptomyces antibiotic regulatory proteins) tsuy (77% de identidad con el regulador de la familia sarp, srry, de s. Rochei) y tsuz (78% de identidad con el regulador de la familia sarp, srrz, de s. Rochei). la presencia de m\u00e1s de un receptor de gamma-butirolactonas, gamma-butirolactona sintetasas y genes de la familia de reguladores sarp en streptomyces no es extra\u00f1o. As\u00ed, s. Rochei posee tres genes receptores de gamma-butirolactona (srra, srrb y srrc) y dos regulador de la familia sarp (srry y srrz) (arakawa et al., 2007). S. Scabies y s. Virginiae poseen dos genes de receptores para gamma-butirolactona y dos genes codificantes de gamma butirolactonas sintetasas (kitani et al., 2008a; kinoshita et al., 1997). S. Fradiae tambi\u00e9n presenta dos genes para receptores de gamma butirolactonas (stratigopoulos et al., 2002). En todos los streptomyces que presentan m\u00e1s de un gen para receptores de gamma-butirolactona agrupados s\u00f3lo uno de ellos es el receptor de gamma butirolactonas real (arakawa et al., 2007). el gen tsur1 es el receptor real butirolactonas en s. Tsukubaensis los receptores de gamma-butirolactona y sus hom\u00f3logos pueden ser clasificados en dos grupos: i) un grupo de receptores autoregulatodos reales cuya uni\u00f3n se verifica bioqu\u00edmicamente: ii) y un grupo de pseudo-receptores, que parecen no tener clara actividad de uni\u00f3n (kitani et al., 2008a; matsuno et al., 2004). Los dos grupos se pueden diferenciar por los valores de pi de la prote\u00edna, ya que los receptores reales presentan valores \u00e1cidos, mientras que los pseudo-receptores muestran valores muy b\u00e1sicos.   el gen tsur1 codifica la prote\u00edna de 225 amino\u00e1cidos con un peso molecular de 24 kda y un pi de 5,51. Mientras que la prote\u00edna tsur2 posee 212 amino\u00e1cidos, un peso molecular de 21,9 kda y un pi de 10,15. Ambas prote\u00ednas tsur1 y tsur2 presentan el amino\u00e1cido tript\u00f3fano (w) en la h\u00e9lice \u00c2\u00bf7, que se conserva bien entre los autoreguladores de este tipo y es considerado como un residuo importante para la formaci\u00f3n lugares de uni\u00f3n (natsume et al., 2004). la prote\u00edna tsur1 presenta una funci\u00f3n autorreguladora para el an\u00e1lisis de la funci\u00f3n autorreguladora de las prote\u00ednas tsur1 y tsur2 se realizaron ensayos de emsa y de protecci\u00f3n de adn frente a adnasa i (footprinting). Estas prote\u00ednas, al contrario de la prote\u00edna gbr, son muy estables y no pierden su actividad con el tiempo lo que permiti\u00f3 hacer estos ensayos. As\u00ed, una secuencia protegida fue identificada en la regi\u00f3n interg\u00e9nica tsur1 tsuwk, la cual mediante el an\u00e1lisis de footprinting con la prote\u00edna tsur1 se identific\u00f3 como aaaatacggactacctggtttggttctg (posici\u00f3n -56, respecto al inicio de transcripci\u00f3n). Dicha secuencia es bastante similar a la secuencia consenso are. Este resultado demuestra que la prote\u00edna tsur1 tiene actividad de autorregulaci\u00f3n.  en cuanto a la prote\u00edna tsur2, se identific\u00f3 una secuencia protegida en la regi\u00f3n interg\u00e9nica tsur2-tsus2. Mediante el an\u00e1lisis de footprinting se caracteriz\u00f3 la secuencia como: tcttaacaaaccgcttggacggtttata (posici\u00f3n: -331) presentando una alta similitud a la secuencia consenso are.  la comparaci\u00f3n con los receptores gamma-butirolactonas en otros streptomyces (arakawa et al., 2007; kitani et al., 2008a; kinoshita et al., 1997) y la caracterizaci\u00f3n molecular de las prote\u00ednas tsur1 y tsur2 nos permite confirmar que tsur1 es el receptor real de butirolactonas en s. Tsukubaensis y tsur2 es un posible pseudo-receptor. el receptor de butirolactonas tsur1 regula la expresi\u00f3n del un regulador de la familia sarp tsuy numerosos reguladores de la familia sarp se han caracterizado conjuntamente con agrupaciones de genes de bios\u00edntesis de antibi\u00f3ticos o reguladores de su producci\u00f3n, ya que suelen albergar al menos un gen que codifica para una prote\u00edna sarp (aigle et al., 2005; wietzorrek y bibb, 1997). Algunas agrupaciones, sin embargo, poseen m\u00e1s de un gen codificante de prote\u00ednas sarp, como los genes de bios\u00edntesis de pristinamicina en s. Pristinaespiralis (folcher et al., 2001), la agrupaci\u00f3n de genes reguladores de lankacidina y lankamicina en s. Rochei (mochizuki et al., 2003), los genes de la bios\u00edntesis de aclacinomicina en s. Galilaeus (raty et al., 2002) la agrupaci\u00f3n de genes de la bios\u00edntesis de tilosina en s. Fradiae (bate et al., 1999). los reguladores sarp reconocer repeticiones heptam\u00e9ricas directas en las cajas  35 de los promotores de los genes regulados (arias et al., 1999; sheldon et al., 2002; garg y parry, 2010). Despu\u00e9s de unirse a estas repeticiones directas espec\u00edficas, los reguladores sarp facilitan la uni\u00f3n de la arn polimerasa al inicio de la transcripci\u00f3n de los genes (takana et al., 2007). La familia de genes reguladores sarp suelen ser dianas de los receptores de gamma-butirolactona (folcher et al., 2001; takano et al., 2005), excepto en el caso de arpa, cuya diana es el gen adpa, un gen regulador transcripcional de la familia arac. ensayos de protecci\u00f3n demostraron que la prote\u00edna tsur1 se une espec\u00edficamente a una gran secuencia de la regi\u00f3n promotora del gen tsuy, la cual contiene dos cajas de are (una en la cadena codificante y el otra en la cadena complementaria. En s. Fradiae, el receptor de butirolactona tylp reprime la expresi\u00f3n del gen sarp tyls (bignell et al., 2007; stratigopoulos et al., 2002), lo que resulta en la represi\u00f3n de tylr, un gen que codifica un activador espec\u00edfico en la bios\u00edntesis de tilosina (stratigopoulos et al., 2004). En s. Pristinaespiralis, spbr se une a promotor del gen papr1 (sarp), y regula la s\u00edntesis de pristinamicina (folcher et al., 2001). la prote\u00edna tsuy contienen un dominio regulador transcripcional (trans_reg_c) en n-terminal, y un dominio activador transcripcional bacteriano (btad) en el extremo c-terminal caracter\u00edstico de reguladores sarp al igual que sucede en la prote\u00edna tsuz de la agrupaci\u00f3n tsu. s. Tsukubaensis presenta dos genes codificantes de butirolactonas sintetasas los receptores de butirolactonas suelen ocupar un alto nivel en la cascada de regulaci\u00f3n espec\u00edfica de v\u00eda para la regulaci\u00f3n de la s\u00edntesis de antibi\u00f3ticos. Por ello, las butirolactonas sintetasas tambi\u00e9n poseen una funci\u00f3n importante en esta cascada. De forma similar a lo que sucede en el sistema afsa-arpa, sistemas similares de butirolactonas se han encontrado en otros estreptomicetos, por ejemplo, el sistema de barx-bara en s. Virginiae (kawachi et al., 2000), farx-fara en s. Lavendulae (kitani et al., 2001), scba-scbr en s. Coelicolor a3(2) (takano et al., 2001) y srrx-srra en s. Rochei (arakawa et al., 2007). Sin embargo, sus efectos en la producci\u00f3n de antibi\u00f3ticos y diferenciaci\u00f3n morfol\u00f3gica son dependientes de especie. hay dos hipot\u00e9ticas butirolactonas sintetasas (tsus1 y tsus2) en la agrupaci\u00f3n g\u00e9nica tsu en s. Tsukubaensis. Estas prote\u00ednas tsus1 y tsus2 poseen dos dominios pfam03756 en sus extremos n- y c-terminales. Casi todas las prote\u00ednas que presentan un dominio pfam03756 presentes en las bases de datos son hom\u00f3logos de la prote\u00edna afsa de streptomyces (kato et al., 2007). El an\u00e1lisis mediante emsa mostr\u00f3 que tsur1 se une a las regiones promotoras de los genes tsus1 y tsus2 reprimiendo posiblemente su transcripci\u00f3n. La represi\u00f3n de las butirolactonas sintetasa por un receptor de butirolactonas ha sido descrita recientemente en s. Coelicolor (mehra et al., 2008). citocromo p450: objetivo de tsur el gen tsub, que codifica un citocromo p450, es una de las dianas de tsur1 como se ha visto por emsa y ensayos de protecci\u00f3n. Este gen posee un cod\u00f3n tta en los nucle\u00f3tidos 73 a 75, el cual es reconocido por blda (trnaleu) en diferentes streptomyces (tao et al., 2007; takano et al., 2003). Este cod\u00f3n no ha sido localizado en los otros genes de la agrupaci\u00f3n reguladora tsu. El gen ort\u00f3logo tsub en s. Fradiae (orf16, que participa en la bios\u00edntesis de butirolactona), as\u00ed como tylp (receptor de butirolactona), tyls y tylt (reguladores sarp) y tylr contienen un solo cod\u00f3n tta (bingnel et al., 2007; bate et al., 1999). En s. Coelicolor el gen blda se expresa predominantemente en la fase estacionaria tard\u00eda (leskiw et al., 1993) y es necesario para la traducci\u00f3n de los codones de leucina escasos en prote\u00ednas reguladoras espec\u00edficas de v\u00eda que est\u00e1n involucradas en la diferenciaci\u00f3n de la colonia, la formaci\u00f3n de micelio a\u00e9reo y la producci\u00f3n de antibi\u00f3ticos (chater y chandra, 2008; white y bibb, 1997; guthrie et al., 1998). genes controlados por el pseudo receptor de butirolactonas tsur2  curiosamente, la prote\u00edna tsur2, que es una prote\u00edna de la familia tetr y un posible pseudo receptor de butirolactona en s. Tsukubaensis, se une a las mismas regiones promotoras que tsur1 prote\u00edna. Las prote\u00ednas de la familia tetr contiene dos dominios funcionales de forma independiente, un dominio de uni\u00f3n al adn y un dominio regulador (ramos et al., 2005). Recientemente se ha descrito que los pseudo receptores de  butirolactonas tambi\u00e9n desempe\u00f1an una funci\u00f3n espec\u00edfica en la bios\u00edntesis de antibi\u00f3ticos al unirse y responder a se\u00f1ales de los antibi\u00f3ticos usando sus dominios reguladores (novakova et al., 2010; xu et al., 2010). En s. Aureofaciens el regulador aur1r (un hom\u00f3logo de tsur2) espec\u00edficamente reprime la expresi\u00f3n del gen aur1p, que codifica un activador espec\u00edfico de ruta del grupo de genes de bios\u00edntesis auricina. Pero esta represi\u00f3n se libera con auricina o sus intermediarios (novakova et al., 2010). la funci\u00f3n de uni\u00f3n a los antibi\u00f3ticos de los pseudo receptores de butirolactonas tambi\u00e9n se ha descrito sobre las prote\u00ednas scbr2 y jadr2 (xu et al., 2010). La prote\u00edna scbr2 de s. Coelicolor puede unirse a los antibi\u00f3ticos end\u00f3genos actinorodina y undecilprodigiosina como ligandos, que conducen a la des represi\u00f3n de kaso, un activador de una agrupaci\u00f3n cr\u00edptica de polic\u00e9tido sintasas tipo i. Al igual que scbr2, jadr2 de s. Venezuelae tambi\u00e9n puede unirse a los antibi\u00f3ticos cloranfenicol y jadomicina, cuyas interacciones conducen a la des represi\u00f3n de jadr1, que activa la bios\u00edntesis de jadomicina mientras reprime directamente la bios\u00edntesis cloranfenicol. existen diferentes polic\u00e9tido sintetasas (como tsua) situadas alrededor de la agrupaci\u00f3n reguladora tsu que podr\u00edan estar involucradas en la producci\u00f3n de algunos polic\u00e9tidos no identificados diferentes del tacrolimus. Sin embargo, el orden jer\u00e1rquico de estos genes (y tal vez otros) en la cascada de regulaci\u00f3n que controla la producci\u00f3n de tacrolimus u otro metabolito polic\u00e9tido debe establecerse. efecto de la deleci\u00f3n de los genes de la agrupaci\u00f3n tsu sobre la producci\u00f3n de tacrolimus en s. Tsukubaensis existen varios estudios de mutag\u00e9nesis de los receptores de gamma-butirolactonas. En su mayor\u00eda, la eliminaci\u00f3n del receptor afecta (positiva o negativamente) a la producci\u00f3n de antibi\u00f3ticos y rara vez sucede que no tenga ning\u00fan efecto sobre la producci\u00f3n. As\u00ed, la supresi\u00f3n de fara en s. Lavendulae (kitani et al., 2001), brp en s. Clavuligerus (santamarta et al., 2005), tylp en s. Fradiae (bate et al., 1999) y sngr en s. Natalensis (lee et al., 2005) mejoran la producci\u00f3n de antibi\u00f3ticos. en cuanto a s. Tsukubaensis la producci\u00f3n de tacrolimus se redujo dr\u00e1sticamente en las cepas mutantes \u00c2\u00bftsur1, mientras que la deleci\u00f3n de gene tsur2 no mostr\u00f3 ning\u00fan efecto detectable sobre la producci\u00f3n de tacrolimus. Esta carencia de efecto sobre la producci\u00f3n abunda en la idea de que el gen tsur2 en un pseudo-receptor.  adem\u00e1s, el mutante \u00c2\u00bftsur1 produjo un pigmento de color rosa en el medio de fermentaci\u00f3n el cual no est\u00e1 presente en la cepa silvestre y ni en la cepa mutante \u00c2\u00bftsur2. Esta producci\u00f3n de pigmentos en el medio por parte del mutante \u00c2\u00bftsur1 se inici\u00f3 despu\u00e9s de 3 d\u00edas de cultivo lo que sugiere que la prote\u00edna tsur1 act\u00faa como un regulador negativo en la bios\u00edntesis de este compuesto. la supresi\u00f3n de genes de las butirolactonas sintetasas tsus1 y tsus2 disminuy\u00f3 ligeramente la producci\u00f3n de tacrolimus en los mutantes. Mientras que la deleci\u00f3n de los genes tsuy o tsuz no mostraron ning\u00fan efecto aparente en la producci\u00f3n de tacrolimus. efectos fenot\u00edpicos de la deleci\u00f3n de los diferentes genes de la agrupaci\u00f3n tsu  el efecto fenot\u00edpico de la mutaci\u00f3n en los distintos genes de la agrupaci\u00f3n tsu se analiz\u00f3 por comparaci\u00f3n de los diferentes mutantes (\u00c2\u00bftsur1, \u00c2\u00bftsur2, \u00c2\u00bftsus1, \u00c2\u00bftsus1, \u00c2\u00bftsuy y \u00c2\u00bftsuz) con la cepa silvestre en medio s\u00f3lido isp4. As\u00ed, la morfolog\u00eda de cada mutante fuer fotografiada despu\u00e9s de 7 d\u00edas de crecimiento a 28 \u00c2\u00b0c y las mismas colonias fueron utilizadas para analizar la esporulaci\u00f3n. la morfolog\u00eda de las colonias mutantes fue muy diferente en comparaci\u00f3n con la cepa silvestre de s. Tsukubaensis. La cepa \u00c2\u00bftsur1 forma peque\u00f1as colonias, que son de color amarillo en el centro (micelio a\u00e9reo sin esporulaci\u00f3n) y las esporas de color gris alrededor de la colonia. Mientras que el mutante \u00c2\u00bftsur2 presenta grandes colonias, que est\u00e1n totalmente esporuladas. Por lo tanto el gen tsur2 tiene un efecto negativo sobre la esporulaci\u00f3n. Las colonias relacionadas con los mutantes \u00c2\u00bftsus1 y \u00c2\u00bftsus2 son m\u00e1s peque\u00f1as que la cepa silvestre y presentan un hundimiento en el centro y una capa de esporas alrededor de la colonia. Estos mutantes forman colonias irregulares. Las colonias \u00c2\u00bftsuy y \u00c2\u00bftsuz son grandes, amarillas, con micelio a\u00e9reo voluminoso en el centro y las esporas alrededor de las colonias. Las colonias del mutante \u00c2\u00bftsuz poseen un mayor n\u00famero de esporas de color gris en comparaci\u00f3n con las colonias \u00c2\u00bftsuy. en cuanto al inicio de la esporulaci\u00f3n en medio isp4, la cepa \u00c2\u00bftsur1 present\u00f3 esporas al menos 1 d\u00eda m\u00e1s tarde que las otras cepas, aunque despu\u00e9s de 7 d\u00edas estaba totalmente esporulada. La cepa \u00c2\u00bftsuz presentaba micelio a\u00e9reo de color blanco hasta los 5 d\u00edas, tras lo cual cambi\u00f3 a color gris (esporas). En cuanto a la cepa \u00c2\u00bftsuy, incluso despu\u00e9s de 7 d\u00edas todav\u00eda aparec\u00eda micelio a\u00e9reo blanco en el centro y las esporas s\u00f3lo eran visibles en el borde del cultivo. Las esporas de las cepas mutantes \u00c2\u00bftsur1, \u00c2\u00bftsur2 y \u00c2\u00bftsus2 eran m\u00e1s oscuras que la cepa silvestre, mientras que la cepa \u00c2\u00bftsur2 presentaba una mejor esporulaci\u00f3n que la cepa silvestre. optimizaci\u00f3n de medio de producci\u00f3n de tacrolimus en s. Tsukubaensis la composici\u00f3n los medios de cultivo suele presentar una relaci\u00f3n directa con la bios\u00edntesis de antibi\u00f3ticos (elibol y mavituna, 1998; elibol, 2004). Por ello, el control de la regulaci\u00f3n del metabolismo a trav\u00e9s de diversos elementos como fuetes de carbono, nitr\u00f3geno, amino\u00e1cidos o elementos minerales es un punto interesante para incrementar la producci\u00f3n de metabolitos secundarios en los microorganismos (gesheva et al., 2005; kim y park, 2008; singh y behera, 2009). diferentes estrategias se pueden utilizar para la optimizaci\u00f3n de las condiciones de cultivo y producci\u00f3n (mao et al., 2007; farid et al., 2000). En este estudio se fueron optimizando factores de manera individual analizando la producci\u00f3n final de tacrolimus. As\u00ed, todas las fermentaciones se realizaron por triplicado en matraces lisos de 500 ml con 100 ml de medio l\u00edquido isp4, incubaci\u00f3n a 28 \u00c2\u00b0c y agitaci\u00f3n orbital de 220 rpm. Las condiciones seleccionadas se acumularon para el siguiente paso de optimizaci\u00f3n. La fuente de carbono metabolizable de forma r\u00e1pida (glucosa) y sostenible (metabolismo lento: dextrina de ma\u00edz)], el agente tamponante y el ph del medio se constataron como factores clave en la producci\u00f3n de tacrolimus. Por lo tanto, se ha desarrollado un medio qu\u00edmicamente definido para s. Tsukubaensis, que es adecuado para el estudio de la regulaci\u00f3n del metabolismo de la s\u00edntesis de tacrolimus. El medio final optimizado, denominado medio isp-z, posee la siguiente composici\u00f3n, con un ph ajustado a 6,5: con las condiciones descritas anteriormente la producci\u00f3n de tacrolimus comenz\u00f3 a las 20 horas del inoculo inicial y el t\u00edtulo volum\u00e9trico de tacrolimus en este medio fue de 90  mg\/ml con la m\u00e1xima producci\u00f3n espec\u00edfica de 14,88 1,8 mg\/mg.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Caracterizaci\u00f3n de los receptores de gamma butirolactonas en las especies productoras de tacrolimus streptomyces tacrolimicus y streptomyces tsukubaensis. an\u00e1lisis de sus sistemas de auto-regulaci\u00f3n<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Caracterizaci\u00f3n de los receptores de gamma butirolactonas en las especies productoras de tacrolimus streptomyces tacrolimicus y streptomyces tsukubaensis. an\u00e1lisis de sus sistemas de auto-regulaci\u00f3n <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Zahra Salehi Najafabadi <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Le\u00f3n<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 17\/12\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Carlos Barreiro M\u00e9ndez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: paloma Liras pad\u00edn <\/li>\n<li>Marta Rodr\u00edguez s\u00e1iz (vocal)<\/li>\n<li>Juan Soliveri de carranza (vocal)<\/li>\n<li>Alberto Sola landa (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Zahra Salehi Najafabadi Resumen caracterizaci\u00f3n del gen receptor de butirolactonas de s. 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