{"id":106658,"date":"2011-04-02T00:00:00","date_gmt":"2011-04-02T00:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"2011-04-02T00:00:00","modified_gmt":"2011-04-02T00:00:00","slug":"estudios-moleculares-e-inmunobiologicos-de-la-protea%c2%adna-tbpa-receptor-de-transferrina-de-haemophilus-parasuis-y-de-otras-protea%c2%adna-de-membrana-externa-con-afinidad-por-la-transferrina-porc","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/vacunas\/estudios-moleculares-e-inmunobiologicos-de-la-protea%c2%adna-tbpa-receptor-de-transferrina-de-haemophilus-parasuis-y-de-otras-protea%c2%adna-de-membrana-externa-con-afinidad-por-la-transferrina-porc\/","title":{"rendered":"Estudios moleculares e inmunobiol\u00f3gicos de la prote\u00edna tbpa (receptor de transferrina) de haemophilus parasuis y de otras prote\u00edna de membrana externa con afinidad por la transferrina porcina"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Rafael Frandoloso <\/strong><\/h2>\n

Haemophilus parasuis, bacilo gram negativo, es el agente etiol\u00f3gico de la enfermedad de gl\u00ed\u00a4sser, que se caracteriza por poliserositis, poliartritis y meningitis en el ganado porcino. Se trata de una de las enfermedades emergentes de mayor inter\u00e9s actualidad relacionado con los nuevos m\u00e9todos de producci\u00f3n intensiva, de alto estatus sanitario, utilizados en esta especie animal. Hasta la fecha, la industria no ha sido capaz de desarrollar vacunas que protejan de la enfermedad producida por cualquiera de los serotipos en los que se dividide esta especie bacteriana, ya que s\u00f3lo se han observado respuestas eficaces frente al serotipo hom\u00f3logo. Estos problemas se encuentran directamente relacionados con la variabilidad fenot\u00edpica de h. Parasuis y con los escasos conocimientos disponibles acerca de la patogenia de la enfermedad y de la interacci\u00f3n de este microorganismo con el sistema inmune porcino. teniendo en consideraci\u00f3n la importancia del hierro en el metabolismo de h. Parasuis, se han desarrollado en esta tesis doctoral, diferentes formulaciones vacunales basadas en prote\u00ednas directamente implicadas en la adquisici\u00f3n de este oligoelemento al formar parte del receptor dispuesto en la membrana externa de la bacteria. El estudio de su potencial protector se llev\u00f3 a cabo en cerdos privados de calostro, con especial \u00e9nfasis en el an\u00e1lisis de la evoluci\u00f3n de las diferentes subpoblaciones de c\u00e9lulas mononucleares de la sangre perif\u00e9rica, de la expresi\u00f3n de citoquinas y quimioquinas implicadas en las respuestas inmunes innata y adquirida y en el estudio de la interacci\u00f3n in vitro de h. Parasuis con c\u00e9lulas epiteliales de ri\u00f1\u00f3n porcino. previamente hubo de ponerse a punto un protocolo de obtenci\u00f3n de cerdos privados de calostro porcino, con el que se logr\u00f3 m\u00e1s de un 90% de supervivencia. Se trabaj\u00f3 en todos los casos con la cepa nagasaki, del serotipo 5 de h. Parasuis, uno de los serotipos considerado m\u00e1s virulentos y referencia habitual de esto. En cuanto a los ant\u00edgenos vacunales que sirvieron de base para la preparaci\u00f3n de las diferentes vacunas, se recurri\u00f3 a t\u00e9cnicas moleculares para la obtenci\u00f3n de un fragmento recombinante de 200 amino\u00e1cidos de la prote\u00edna tbpa de h. Parasuis (rtbpa), a la vez que se purific\u00f3, mediante cromatograf\u00eda de afinidad, un grupo de prote\u00ednas nativas con afinidad por la transferrina porcina (pnatp). Por otra parte, se utiliz\u00f3 un fragmento recombinante de 102 amino\u00e1cidos de la prote\u00edna tbpb (rtbpb) desarrollada previamente en nuestro laboratorio por del r\u00edo (2004). Ambas prote\u00ednas recombinantes fueron capaces de inducir buenos niveles de anticuerpos policlonales en conejo, los cuales pudieron reconocer las correspondientes prote\u00ednas nativas expresadas en la superficie bacteriana. con estos ant\u00edgenos se desarrollaron cuatro formulaciones vacunales diferentes; las dos 1\u00aa integradas por cada una de las dos prote\u00ednas recombinantes, que fueron completadas con un adyuvante a base de aceite comercial montanide ims 2215 vg pr y administradas por v\u00eda intramuscular (rtbpa y rtbpb); una tercera compuesta por las pnatp, el mismo adyuvante y la misma v\u00eda de inoculaci\u00f3n (pnatpim) y una cuarta en la que la administraci\u00f3n fue intratraqueal y el ant\u00edgeno id\u00e9ntico, pero con un adyuvante constituido de nuevo estaba constituido por la neuraminidasa de clostridium perfringens (pnatpit). Se incluy\u00f3 adem\u00e1s en el estudio una bacterina comercial (porcilis gl\u00ed\u00a4sser, pg) formulada con el mismo serotipo en el resto de formulaciones antig\u00e9nicas. los resultados obtenidos de la comparaci\u00f3n de las cinco formulaciones vacunales pusieron de manifiesto el efecto protector total (100%) de las identificadas como pnatpim, pnatpit y pg frente al desaf\u00edo con una dosis letal (de 3\u00ed–108 ufc) de la cepa nagasaki de h. Parasuis. Las vacunas rtbpa y rtbpb confirieron \u00fanicamente una protecci\u00f3n del 33% y 20%, respectivamente, y el grupo de cerdos control, infectados pero no vacunados, desarrollaron los s\u00edntomas y lesiones t\u00edpicos de la enfermedad y murieron durante las primeras 48 horas posteriores a la infecci\u00f3n-desaf\u00edo con una dosis letal de h. Parasuis. el an\u00e1lisis de la respuesta inmune celular desarrollado mediante citometr\u00eda de flujo (utilizando un panel de anticuerpos monoclonales frente a los ant\u00edgenos leucocitarios de superficie cd3, cd8a, cd8b, cd4, cd4 na\u00ed\u00afve, tcrgd, aigm, cd21, cd163, cd172a, sla-drii, cd16 y cd45ra) revel\u00f3 alteraciones de inter\u00e9s in\u00e9ditas hasta el momento. Como consecuencia del desaf\u00edo, los cerdos no inmunizados desarrollaron una linfopenia grave, con un descenso significativo de la poblaci\u00f3n de linfocitos tgd. Se observ\u00f3 un incremento de los linfocitos t citot\u00f3xicos y de c\u00e9lulas nk, adem\u00e1s de alteraciones en la expresi\u00f3n de las mol\u00e9culas de histocompatibilidad de clase ii en los monocitos. Se obtuvieron resultados similares en los animales vacunados con las formulaciones rtbpa y rtbpb que murieron despu\u00e9s del desaf\u00edo. Se observ\u00f3 tambi\u00e9n una respuesta intensa de linfocitos b (aigm+ cd21+) en los animales bien protegidos frente al desaf\u00edo, pero no el resto de alteraciones descritas en los grupos experimentales restantes, lo que puso de manifiesto el efecto protector de las vacunas pnatpim, pnatpit y pg. mediante pcr cuantitativa se analiz\u00f3 la expresi\u00f3n de diversas citoquinas y quimioquinas tras el desaf\u00edo en varios \u00f3rganos linfoides secundarios (bazo y ganglios traqueobronquiales, mediast\u00ednicos y mandibulares) y en los \u00f3rganos blanco de la infecci\u00f3n (pulm\u00f3n y cerebro); se incluy\u00f3 adem\u00e1s el h\u00edgado, debido al car\u00e1cter invasivo de esta especie bacteriana y por la funci\u00f3n que desempe\u00f1a este \u00f3rgano en la s\u00edntesis de las prote\u00ednas de fase aguda. Tambi\u00e9n se utiliz\u00f3 esta t\u00e9cnica molecular para la identificaci\u00f3n de h. Parasuis en todas las muestras estudiadas, mediante la cuantificaci\u00f3n de la transcripci\u00f3n del gen infb. los resultados obtenidos demostraron que los cerdos no inmunizados y los vacunados con rtbpa o rtbpb transcrib\u00edan niveles elevados de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias (il-1a, il-1b, tnf-a, il-6, inf-g, il-10, ccl2 e il-8) en todas las muestras, como consecuencia de la infecci\u00f3n desarrollada. Sin embargo, los animales protegidos s\u00f3lo presentaron un incremento significativo en la transcripci\u00f3n de la il-5, lo que justifica la ausencia de un proceso inflamatorio mediado por citoquinas y una respuesta th2, coincidiendo con el aumento de los porcentajes de linfocitos b perif\u00e9ricos y de los fol\u00edculos germinales de los bazos de los cerdos protegidos. el gen infb permiti\u00f3 el estudio de la distribuci\u00f3n de h. Parasuis en las diferentes muestras y se pudo establecer la correlaci\u00f3n entre el nivel de transcripci\u00f3n de las citoquinas y quimioquinas proinflamatorias y la presencia o ausencia de h. Parasuis en los \u00f3rganos. Adem\u00e1s, los cerdos no protegidos y m\u00ednimamente protegidos presentaban casi un 100% de muestras positivas a este microorganismo, mientras que los animales bien protegidos tan solo presentaban alguna muestra con arnm bacteriano. Las cantidades de arnm encontradas en estos \u00faltimos cerdos fueron significativamente menores que las obtenidas a partir de los animales control o vacunados con rtbpa o rtbpb, lo que pone de manifiesto de nuevo la capacidad protectora de las vacunas pnatpim, pnatpit y pg. finalmente, por medio de una infecci\u00f3n in vitro, hemos demostrado que h. Parasuis presenta capacidad para adherirse e internalizarse en c\u00e9lulas de ri\u00f1\u00f3n porcino. Este resultado contribuye a la mejor comprensi\u00f3n de la patogenia de la enfermedad de gl\u00ed\u00a4sser.<\/p>\n

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Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abEstudios moleculares e inmunobiol\u00f3gicos de la prote\u00edna tbpa (receptor de transferrina) de haemophilus parasuis y de otras prote\u00edna de membrana externa con afinidad por la transferrina porcina<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
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  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudios moleculares e inmunobiol\u00f3gicos de la prote\u00edna tbpa (receptor de transferrina) de haemophilus parasuis y de otras prote\u00edna de membrana externa con afinidad por la transferrina porcina <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Rafael Frandoloso <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Le\u00f3n<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 04\/02\/2011<\/li>\n<\/ul>\n

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    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
      \n
    • Director de la tesis<\/strong>\n
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      • Cesar Bernardo Gutierrez Mart\u00edn<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
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        • Presidente del tribunal: lucas Dom\u00ednguez rodr\u00edguez <\/li>\n
        • Javier Dom\u00ednguez juncal (vocal)<\/li>\n
        • mateo Pozo vegas (vocal)<\/li>\n
        • Juan anselmo Perea remujo (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

           <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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