{"id":107054,"date":"2018-03-11T10:31:15","date_gmt":"2018-03-11T10:31:15","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/is-the-extracellular-atp-a-key-in-x-linked-charcot-marie-tooth-disease-and-in-inherited-non-syndromic-deafness\/"},"modified":"2018-03-11T10:31:15","modified_gmt":"2018-03-11T10:31:15","slug":"is-the-extracellular-atp-a-key-in-x-linked-charcot-marie-tooth-disease-and-in-inherited-non-syndromic-deafness","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/barcelona\/is-the-extracellular-atp-a-key-in-x-linked-charcot-marie-tooth-disease-and-in-inherited-non-syndromic-deafness\/","title":{"rendered":"Is the extracellular atp a key in x-linked charcot-marie-tooth disease and in inherited non-syndromic deafness?"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Ezequiel Mas  Del Molino <\/strong><\/h2>\n<p>Resumen de la tesis:\t introducci\u00f3n: el atp es una mol\u00e9cula ampliamente conocida por su papel en muchas funciones fisiol\u00f3gicas intracelulares. Pero el atp puede actuar como mol\u00e9cula se\u00f1alizadora a trav\u00e9s de los receptores purin\u00e9rgicos p2, los p2x, que son ionotr\u00f3picos, y los p2y que son metabotr\u00f3picos. Los p2x son canales i\u00f3nicos que se abren cuando se les une el atp. Los p2y son receptores acoplados a prote\u00ednas g. Ambos tipos de receptores se han relacionado con diferentes patolog\u00edas. Los metbolitos del atp, fruto de su hidr\u00f3lisis por las ntpdasas (adp, amp y adenosina)  tambi\u00e9n pueden activar otros receptores purin\u00e9rgicos denominados p1 o receptores de adenosina que est\u00e1n acoplados a prote\u00ednas g (figura 1).  figura 1 | esquema de la se\u00f1alizaci\u00f3n purin\u00e9rgica. Podemos observar como el atp directamente puede activar los receptores p2, sin embargo, metab\u00f3litos del atp (adp, amp y adenosina) tambi\u00e9n activan otro tipo de receptores p1.  la liberaci\u00f3n celular de atp es por exocitosis o por transportadores de atp. Investigaciones recientes indican que algunos hemicanales formados por conexinas (cx) podr\u00edan liberar atp mediante est\u00edmulo. las conexinas son prote\u00ednas de membrana formadas por cuatro dominios transmembrana y con los extremos amino y carboxi terminal citoplasm\u00e1ticos. Las 21 conexinas descritas en el hombre difieren entre ellas por pocos amino\u00e1cidos. Las conexinas forman hex\u00e1meros llamados  conexones. Dos conexones de dos c\u00e9lulas adyacentes forman una uni\u00f3n tipo comunicante o gap junction. Cuando un conex\u00f3n se encuentra en una membrana que no est\u00e1 en contacto con otra c\u00e9lula forma un canal llamado hemicanal (figura 2).  figura 2 | a; dibujo esquem\u00e1tico de las gap junctions. Cada c\u00e9lula contribuye con un conex\u00f3n para formar una una gap junction. B; modelo topol\u00f3gico de una conexina. Hay 4 dominios transmembrana (m1-m4), dos asas extracelulares y una de intracelular. Los extremos amino y carboxi terminales son intracelulares (s\u00ed\u00b6hl &#038; willecke, 2004).  se sabe que los hemicanales pueden abrirse en condiciones fisiol\u00f3gicas y en condiciones patol\u00f3gicas. Tambi\u00e9n se ha podido estudiar que son permeables a iones y a metobolitos. Los canales formados por conexinas tienen una sensibilidad compleja. La mayor\u00eda de ellos tienen una conductancia sensible al potencial el\u00e9ctrico.  hcx32: la enfermedad hereditaria de charcot-marie-tooth (cmt) agrupa a varias formas de neuropat\u00edas perif\u00e9ricas hereditarias, afectando la funci\u00f3n motora y la sensorial, y tienenuna elevada preValencia en la poblaci\u00f3n. La forma de esta enfermedad ligada al cromosoma x (cmtx) se debe a las mutaciones en el gen que codifica la conexina 32 (cx32 o hcx32). Se conoces m\u00e1s de 290 mutaciones en este gen. la cx32 est\u00e1 localizada en las hendiduras de schmidt-lanterman y en las zonas paranodales de las c\u00e9lulas de schwann (cs), pero no se sabe qu\u00e9 papel fisiol\u00f3gico est\u00e1n jugando. Uno de los hipot\u00e9ticos roles ser\u00eda crear un atajo para comunicar de manera r\u00e1pida la zona perinuclear y la zona periaxonal de la cs. Nuestra hip\u00f3tesis es que las css se mantienen diferenciadas gracias a un mecanismo purin\u00e9rgico autocrino, dado que expresan en su superficie distintos tipos de receptores p2x y p2y. En consecuencia, el papel de la cx32, seria facilitar la liberaci\u00f3n de atp. Las mutaciones en la cx32 desequilibrar\u00edan la liberaci\u00f3n de atp. Bien sea por un aumento o una disminuci\u00f3n en el atp liberado, por lo que la cs entrar\u00eda en apoptosis, produci\u00e9ndose una lesi\u00f3n en la fibra nerviosa (figura 3).  figura 3 | representaci\u00f3n esquem\u00e1tica de una c\u00e9lula de schwann en tres diferentes situaciones. A; en una c\u00e9lula de schwann expresando la cx32 wt el atp es liberado a trav\u00e9s de estas para una correcta funci\u00f3n de la c\u00e9lula. B y c; una c\u00e9lula de schwann expresando una mutaci\u00f3n de la cx32. En b la mutaci\u00f3n incrementa la cantidad de atp liberado hiperactivando los receptores p2. En c la mutaci\u00f3n de la cx32. En este caso la mutaci\u00f3n disminuye la cantidad de atp liberado hipoactivando de los receptores p2. En los casos b y c esa desregulaci\u00f3n llevar\u00eda a la desdiferenciaci\u00f3n de la c\u00e9lula de schwann y la consecuente desmielinizaci\u00f3n. hcx26 y hcx30: por otra parte, la sordera es aquel conjunto de problemas relacionados con una audiometr\u00eda por debajo del umbral considerado normal. La sordera sensorineural, no sindr\u00f3mica y prelingual afecta a conexinas. la c\u00f3clea o caracol es el \u00f3rgano que se encarga de convertir las vibraciones mec\u00e1nicas en impulsos nerviosos. El \u00f3rgano de corti, situado en la c\u00f3clea, contiene, entre muchos otros tipos celulares, las c\u00e9lulas pilosas sensoriales internas y externas.  en este estudio nos hemos focalizado en las conexinas 26 y 30. Mutaciones en cualquier de estas dos prote\u00ednas pueden causar sordera de una manera recesiva o dominante dependiendo de la mutaci\u00f3n. hasta el d\u00eda de hoy se sabe que estas dos conexinas est\u00e1n formando una red que comunica, mediante las gap junctions a todas las c\u00e9lulas epiteliales y conectivas de la c\u00f3clea. Adem\u00e1s, tambi\u00e9n se ha demostrado que estas conexinas forman hemicanales, en c\u00e9lulas epiteliales, que desembocan en espacios ba\u00f1ados tanto por la perilinfa como por la endolimfa (figura 4). Nuestro objetivo es caracterizar las propiedades i\u00f3nicas y la permeabilidad para el atp de los hemicanales formados por hcx26, los formados por hcx30 y los formados por diferentes mutaciones de la hcx26 y de la hcx30. figura 4 | esquemas del \u00f3rgano de corti y diferentes partes que lo forman y lo rodean. A: observamos diferentes partes del \u00f3rgano de corti. En verde est\u00e1n resaltadas esas c\u00e9lulas endoteliales que contienen conexinas y en marr\u00f3n aquellas c\u00e9lulas del tejido conectivo que tambi\u00e9n las expresan. B: mapa purin\u00e9rgico de la c\u00f3clea. Observamos como los hemicanales liberar\u00edan atp a los espacios tanto ba\u00f1ados por perilinfa como por endolinfa (hildebrand et al. 2008; zhao et al. 2005).  resultados: hcx32: mediante im\u00e1genes de luminiscencia hemos podido concretar que la liberaci\u00f3n de atp se localiza en las zonas paranodales de los n\u00f3dulos de ranvier donde se localiza la cx32 en los nervios perif\u00e9ricos. En los cultivos de css la liberaci\u00f3n de atp tambi\u00e9n coincide con la localizaci\u00f3n de la cx32. utilizando ovocitos de xenopus que expressan la hcx32 y con la t\u00e9cnica de tevc y luminiscencia, hemos verificado que esta conexina se activa mediante voltaje generando una corriente de salida y una corriente de entrada que se inactiva progresivamente. Durante esta inactivaci\u00f3n observamos una salida de atp (figura 5).  figura 5 | representaci\u00f3n gr\u00e1fica de la corriente y el atp liberado por los hemicanales de hcx32, expresada en ovocitos, cuando son despolarizados. En la parte de arriba vemos la luz emitida cuando el voltaje vuelve a su estado inicial. En el medio observamos la corriente, donde destaca la corriente generada cuando el voltaje ya est\u00e1 de nuevo a  -40 mv. La parte de abajo es una representaci\u00f3n del pulso cuadrado que se utiliza como est\u00edmulo.  los estudios de 5 mutaciones de esta hcx32 (s26l, p87a, \u00c2\u00bf111-116, d178y y r220x) demostraron anomal\u00edas en las corrientes generadas y en la permeabilidad por el atp.   hcx26 y hcx30: utilizando la misma t\u00e9cnica que arriba, hemos demostrado que la hcx26 no es permeable al atp cuando es activada mediante voltaje. sin embargo la hcx30 s\u00ed lo es, pero presenta, en la mayor\u00eda de casos, no presenta la inactivaci\u00f3n de los corrientes de entrada (figura 6). Conforme a la literatura donde se demuestra que las conexinas 26 y 30 forman hemicanales heterom\u00e9ricos, de forma que hemos expresado ambas conexinas conjuntamente en un solo ovocito. Los resultados indican que la hcx26 tiene un papel regulador en estos hemicanales. La hcx26 disminuye el n\u00famero de hemicanales que no son capaces de inactivar sus corrientes de entrada. Adem\u00e1s, estabilizan la cantidad de atp que es liberado a trav\u00e9s de estos canales en condiciones normales y bajas en ca2+, e incrementa la relaci\u00f3n atp\/corriente-entrada de estos hemicanales.  en cuanto a las mutaciones de la conexina hcx26 encontramos que, a excepci\u00f3n de la mutaci\u00f3n n54s, todas ellas son parcialmente permeables al atp, y todas ellas presentan alguna anomal\u00eda en los corrientes de salida y\/o de entrada. Por otro lado, la mutaci\u00f3n t5m de la hcx30, presenta corrientes m\u00e1s peque\u00f1as que la forma normal y, adem\u00e1s, no modifica la falta de inactivaci\u00f3n de las corrientes de entrada.   figura 5 | representaci\u00f3n gr\u00e1fica de la corriente y el atp liberado por los hemicanales de hcx30 cuando son despolarizados. En la parte de arriba vemos la luz emitida gracias a la reacci\u00f3n de la luciferina-luciferasa. Es cuando el voltaje vuelve a los -80 mv iniciales que encontramos las corrientes de entrada que no son capaces de inactivarse conllevando una salida incontrolada de iones entre ellos el atp.  los hemicanales heterom\u00e9ricos formados por mutaciones de la hcx26 y la hcx30 no presentan la correcci\u00f3n en la relaci\u00f3n atp\/corriente-entrada que s\u00ed presentan cuando contienen la hcx26. Adem\u00e1s, tampoco corrigen el n\u00famero de hemicanales que no inactivan las corrientes de entrada.  conclusiones: 1.\tHemos demostrado que los hemicanales de hcx32 liberan atp bajo diferentes est\u00edmulos. 2.\tHemos demostrado que los hemicanales mutados de hcx32 presentan anomal\u00edas en esta liberaci\u00f3n de atp. 3.\tHemos demostrado que los hemicanales de hcx26 no liberan atp cuando los estimulamos el\u00e9ctricamente. 4.\tHemos demostrado que los hemicanales de mutaciones de hcx26 generan corrientes diferentes y, excepto la n54s, liberan atp. 5.\tHemos demostrado que los hemicanales de hcx30 liberan atp y presentan problemas de inactivaci\u00f3n. 6.\tHemos demostrado que los hemicanales de hcx26 regulan la liberaci\u00f3n de atp pero no las corrientes en hemicanales formados por hcx26 y hcx30. 7.\tHemos demostrado que las mutaciones de hcx26 no ejercen esta regulaci\u00f3n en la hcx30. objetivos logrados con en el programa de formaci\u00f3n: durante los 4 a\u00f1os de formaci\u00f3n me he formado como investigador aprendiendo como se trabaja en un laboratorio tanto nacional como internacional. He aprendido como abordar una inc\u00f3gnita cient\u00edfica utilizando la literatura y el razonamiento. Todo esto gracias al aprendizaje de diferentes t\u00e9cnicas:  1.\tWestern blot y immunofluorescencia 2.\tFrap (fluorescence recovery after photobleaching) and sldt (scrap loading dye transfer) 3.\tDye loading 4.\tTevc (two electrode voltage clamp) 5.\tLecturas, im\u00e1genes y v\u00eddeos de luminiscencia. Tratamiento y an\u00e1lisis de im\u00e1genes. 6.\tCirug\u00eda en animales para investigaci\u00f3n 7.\tCultivos primarios y de l\u00edneas celulares eucariotas y cultivos bacterianos 8.\tManipulaci\u00f3n y obtenci\u00f3n de material gen\u00e9tico 9.\tCaptaci\u00f3n de oscilaciones y olas de calcio bibliograf\u00eda: \u00c2\u00bf\tbahima l, aleu j, elias m, mart\u00edn-satu\u00e9 m, muhaisen a, blasi j, marsal j, solsona c. Endogenous hemichannels play a role in the release of atp from xenopus oocytes. J cell physiol. (2006); 206(1):95-102. \u00c2\u00bf\tcolomar a, am\u00e9d\u00e9e t. Atp stimulation of p2x(7) receptors activates three different ionic conductances on cultured mouse schwann cells. Eur j neurosci. (2001); 14(6):927-36. \u00c2\u00bf\tjeng lj, balice-gordon rj, messing a, fischbeck kh, scherer ss. The effects of a dominant connexin32 mutant in myelinating schwann cells. Mol cell neurosci. (2006); 32(3):283-98. \u00c2\u00bf\tzhao hb, yu n, fleming cr. Gap junctional hemichannel-mediated atp release and hearing controls in the inner ear. Proc natl acad sci u s a. (2005); 102(51):18724-9.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Is the extracellular atp a key in x-linked charcot-marie-tooth disease and in inherited non-syndromic deafness?<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Is the extracellular atp a key in x-linked charcot-marie-tooth disease and in inherited non-syndromic deafness? <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Ezequiel Mas  Del Molino <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 25\/02\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Carles Solsona Sancho<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: raul Estevez povedano <\/li>\n<li>luc Leybaert (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Ezequiel Mas Del Molino Resumen de la tesis: introducci\u00f3n: el atp es una mol\u00e9cula ampliamente conocida por 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