{"id":108873,"date":"2011-03-06T00:00:00","date_gmt":"2011-03-06T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudio-genomico-sobre-el-patogeno-vibrio-vulnificus\/"},"modified":"2011-03-06T00:00:00","modified_gmt":"2011-03-06T00:00:00","slug":"estudio-genomico-sobre-el-patogeno-vibrio-vulnificus","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/agentes-patogenos-de-los-alimentos\/estudio-genomico-sobre-el-patogeno-vibrio-vulnificus\/","title":{"rendered":"Estudio gen\u00f3mico sobre el pat\u00f3geno vibrio vulnificus"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Francisco Jose Roig  Molina <\/strong><\/h2>\n<p>La especie v. Vulnificus es una de las especies del g\u00e9nero vibrio cuyo genoma ya ha sido secuenciado en algunas cepas. Las dos cepas secuenciadas, y completamente anotadas, hasta el momento del inicio de la escritura de la presente tesis doctoral, muestran un alto grado de similitud en sus genomas, difiriendo principalmente en el contenido plasm\u00eddico. Esta similitud no refleja el alto grado de plasticidad gen\u00e9tica que deber\u00eda mostrar una especie capaz de actuar como organismo de vida libre, como miembro de la microbiota comensal y como agente pat\u00f3geno, colonizando anfitriones tan diferentes como seres humanos y peces. Es posible que esta similitud sea solo aparente, ya que los dos aislados estudiados son del mismo biotipo (biotipo 1) y ambos se hab\u00edan obtenido de sangre humana. Dada la imposibilidad, al inicio de la presente tesis doctoral, de secuenciar los genomas de representantes de los distintos estilos de vida de v. Vulnificus, la estrategia que hemos utilizado para el an\u00e1lisis de la diversidad gen\u00e9tica de la especie ha sido comparar, mediante hibridaci\u00f3n substractiva, los genomas de cepas seleccionadas por sus caracter\u00edsticas diferenciales (virulencia\/no virulencia ambiental\/cl\u00ednica&#8230;) Y estudiar la presencia de las secuencias encontradas en una colecci\u00f3n de cepas representativa de la diversidad gen\u00e9tica de la especie, ya que est\u00e1 formada por m\u00e1s de 100 cepas de los tres biotipos aisladas de todo el mundo, tanto del ambiente como de muestras cl\u00ednicas humanas y de animales, durante un periodo de m\u00e1s de 30 a\u00f1os.  los resultados obtenidos a lo largo de los distintos cap\u00edtulos de muestran que v. Vulnificus es una especie m\u00e1s variable gen\u00e9ticamente que lo que se deducir\u00eda a partir de la comparaci\u00f3n de los genomas publicados. As\u00ed, en el primer cap\u00edtulo demostramos que la variabilidad intraespec\u00edfica de v. Vulnificus es de hasta un 12%. Este porcentaje es solo comparable al encontrado en otras bacterias pat\u00f3genas como neisseria meningitidis, que puede alcanzar el 7-10% (jordan y cols., 2002).   no hemos encontrado ning\u00fan gen que pueda considerarse como marcador de virulencia para humanos mediante comparaci\u00f3n de genomas entre cepas virulentas para humanos y no virulentas y la posterior b\u00fasqueda por pcr de las secuencias seleccionadas en nuestra colecci\u00f3n de cepas. S\u00ed que hemos detectado polimorfismos que pueden estar relacionados con patogenicidad, en particular, los que afectan a los genes rtxa, ktra y pmeompa-like. El gen rtxa mostr\u00f3 una variabilidad relacionada con el biotipo que ha sido analizada en profundidad en la presente tesis doctoral. En lo que respecta a los genes ktra y pmeompa-like las cepas quedaron distribuidas en dos grupos en base a su variabilidad: cepas cl\u00ednicas de biotipo 1 por un lado y el resto por otro, en el primer caso, y aislados con potencial pat\u00f3geno para humanos, independientemente de su biotipo, y el resto por otro, en el segundo caso. Si estos dos genes son o no genes de virulencia queda por demostrar en posteriores estudios.  adem\u00e1s, encontramos secuencias sin similitud con secuencias conocidas que tambi\u00e9n presentaron una distribuci\u00f3n diferencial entre e intrabiotipos. Estas secuencias se pueden clasificar en tres grupos: secuencias espec\u00edficas de biotipo 2, todas ellas plasm\u00eddicas, secuencias espec\u00edficas de biotipo 2 serovariedad e, y secuencias espec\u00edficas de biotipo 2 serovariedad e y biotipo 3.  es probable que el conjunto de secuencias de distribuci\u00f3n diferencial entre biotipos y serovariedades haya tenido alg\u00fan papel en la divergencia evolutiva de v. Vulnificus. Esta distribuci\u00f3n diferencial puede explicarse por captaci\u00f3n independiente de las mismas por representantes del biotipo 2 o evoluci\u00f3n del biotipo 2 a partir de cepas de biotipo 1 que captaron determinadas secuencias. Respecto al biotipo 3, la teor\u00eda generalmente aceptada es que se trata de un h\u00edbrido entre el biotipo 1 y el 2. Sin embargo, los datos obtenidos en este trabajo, al igual que en otros trabajos (cohen y cols., 2007; bisharat y cols., 2007b; sanjuan y cols., 2011), muestran que se encuentra m\u00e1s pr\u00f3ximo al biotipo 2 que al 1. Otro problema que se plantea a la luz de los datos obtenidos es la aparici\u00f3n de los distintos serotipos dentro del biotipo 2, ya que \u00e9stos no podr\u00edan aparecer por un fen\u00f3meno de evoluci\u00f3n secuencial desde un solo clon, sino como resultado de fen\u00f3menos independientes de adquisici\u00f3n de secuencias por parte de cepas diferentes de biotipo 1, lo que supondr\u00eda un origen polifil\u00e9tico, siendo una de las secuencias captadas el pl\u00e1smido de virulencia, que es espec\u00edfico de biotipo 2 (lee y cols., 2008).  el estudio en profundidad de los pl\u00e1smidos revela que la mayor\u00eda de las cepas de v. Vulnificus poseen pl\u00e1smidos, especialmente las cepas pertenecientes a los biotipos 2 y 3, en los que los pl\u00e1smidos se encuentran presentes en todos los aislados. En el biotipo 1 los pl\u00e1smidos no est\u00e1n tan ampliamente distribuidos, datos que son concordantes con estudios previos (davidson y oliver, 1986). Las cepas estudiadas presentan 29 perfiles plasm\u00eddicos diferentes que, pese a no mostrar relaci\u00f3n entre perfiles y origen, muestran especificidad de biotipo\/serovariedad.  de todos los pl\u00e1smidos encontrados, dos de ellos destacan por su amplia distribuci\u00f3n: el pl\u00e1smido de virulencia para peces de 68-70 kb y un pl\u00e1smido conjugativo de la familia de pl\u00e1smidos-f de 48-56 kb. Hemos encontrado un gen en el pl\u00e1smido de virulencia, el gen vep07, el cual no muestra similitud significativa con ning\u00fan gen conocido (lee y cols., 2008) que resulta un candidato a gen de virulencia dado que mutantes naturales deficientes en este gen no son virulentos para peces. De hecho, este gen no muestra variabilidad en las cepas virulentas analizadas lo que demuestra que est\u00e1 sometido a presi\u00f3n de selecci\u00f3n. el pl\u00e1smido conjugativo est\u00e1 presente en el 90% de las cepas de biotipo 2, en el 100% de las de biotipo 3 y en todos los aislados portadores de pl\u00e1smidos de biotipo 1.  la presencia casi generalizada de los pl\u00e1smidos en v. Vulnificus sugiere que los elementos extracromos\u00f3micos han tenido un papel muy importante en la evoluci\u00f3n de esta especie. De hecho, el pl\u00e1smido de virulencia codifica para un sistema de resistencia a la inmunidad innata de la anguila que permite a la bacteria que lo posee colonizar y sobrevivir en un nuevo h\u00e1bitat (valiente y cols., 2008; lee y cols., 2008b). El pl\u00e1smido conjugativo, por su parte, puede contribuir a la movilizaci\u00f3n de genes entre cepas favoreciendo la variabilidad gen\u00e9tica de la especie. De hecho, se ha demostrado que el pl\u00e1smido de virulencia se transmite entre cepas por conjugaci\u00f3n, cointegrado con el pl\u00e1smido conjugativo (lee y cols., 2008).  la comparaci\u00f3n entre genomas y tipado plasm\u00eddico se examin\u00f3 mediante el an\u00e1lisis de patrones de ribotipado frente a perfiles de pl\u00e1smidos, no mostrando correspondencia entre ambos para el biotipo 1 y 2, pero s\u00ed para el biotipo 3. Estos datos son concordantes con el origen polifil\u00e9tico de los biotipos 1 y 2 propuesto para la especie (sanjuan, 2008) y est\u00e1 apoyado por los datos derivados de la hibridaci\u00f3n substractiva realizada en esta tesis. Asimismo, los datos del biotipo 3 son congruentes con la hip\u00f3tesis de que el biotipo 3 est\u00e1 formado por un solo grupo clonal (bisharat y cols., 2007a). la presencia de m\u00faltiples pl\u00e1smidos en la especie plantea la cuesti\u00f3n de si alguno de ellos es un pl\u00e1smido de resistencia a antibi\u00f3ticos (pl\u00e1smidos r). Para averiguarlo, realizamos pruebas de sensibilidad a diferentes antibi\u00f3ticos con una amplia colecci\u00f3n de cepas de todos los biotipos y serovariedades. Los antibi\u00f3ticos se seleccionaron siguiendo un doble criterio, que se usaran contra vibrion\u00e1ceas y que la resistencia al antibi\u00f3tico estuviera descrita como plasm\u00eddica. No encontramos relaci\u00f3n entre perfil plasm\u00eddico y perfil de resistencias no trat\u00e1ndose, por tanto, de resistencias plasm\u00eddicas asimismo no se encontr\u00f3 relaci\u00f3n entre perfil de resistencia y origen, lugar aislamiento, biotipo o serovariedad del aislado. los datos obtenidos, pese a no poder encontrar una relaci\u00f3n directa con ninguna de las variables estudiadas, fueron interesantes. Un alto porcentaje de cepas de los tres biotipos fueron resistentes a uno o m\u00e1s antibi\u00f3ticos, con porcentajes similares a los descritos en aislados ambientales y cl\u00ednicos humanos de asia y norte am\u00e9rica (radu y cols., 1998; zanetti y cols., 2001; baker-austin y cols., 2009). Pero, a diferencia de otros trabajos, el presente trabajo muestra una concentraci\u00f3n de cepas multirresistentes en aislados derivados de piscifactor\u00edas, hecho que sugiere que la resistencia a antibi\u00f3ticos en v. Vulnificus, especialmente a quinolonas, podr\u00eda estar relacionada con la contaminaci\u00f3n urbana y con el uso inadecuado de estos f\u00e1rmacos en la terap\u00e9utica animal (young, 1993; go\u00f1i-urriza y cols., 2000; biyela y cols., 2004) y, en este caso, especialmente en la terap\u00e9utica en piscicultura. entre los antibi\u00f3ticos de elecci\u00f3n en terapia humana y animal de la vibriosis pertenecen a la familia de las quinolonas (samuelsen y lunestad, 1996b; samuelsen y bergh, 2004; grave y cols., 2008; centers for disease control and prevention, 2009). Encontrando un n\u00famero relativamente alto de cepas resistentes a quinolonas entre aislados de piscifactor\u00eda y comprobando en el laboratorio que la mutaci\u00f3n bajo presi\u00f3n de selecci\u00f3n se produce de manera relativamente f\u00e1cil por lo que pasamos a estudiar los genes que codifican para las dianas de las quinolonas, adn girasa (gyra y gyrb) y topoismerasa tipo iv (parc y pare) y, en especial, unas regiones de los mismos denominadas qrdr (regiones determinantes de resistencia a quinolonas) (okuda y cols., 1999a; okuda y cols., 2006; colquhoun y cols., 2007; rodkhum y cols., 2008) en cepas resistentes naturales, cepas sensibles y los mutantes resistentes obtenidos en el laboratorio.  en v. Vulnificus, las mutaciones halladas en el gen gyra son concordantes con los resultados obtenidos para otras bacterias en estudios anteriores (okuda y cols., 1999a; okuda y cols., 1999c), mostrando en todos los aislados resistentes a quinolonas un cambio en el amino\u00e1cido 83, salvo en uno que tiene un cambio en el amino\u00e1cido 82. Para el gen gyrb, s\u00f3lo hay descritas dos mutaciones que conlleven a la resistencia a quinolonas, pero \u00e9stas no coinciden con las halladas en nuestras cepas. En el caso del gen parc de v. Vulnificus, el gen mutado presenta sustituciones en el amino\u00e1cido 85 (serina por isoleucina) cercano al amino\u00e1cido 80, definido como un punto importante para la resistencia a quinolonas (vila y cols., 1996; heisig, 1996; mouneimne y cols., 1999; okuda y cols., 1999a; akasaka y cols., 2001). Las mutaciones en esta zona, cambian la carga electromagn\u00e9tica volviendo la zona hidrof\u00f3bica, lo que favorecer\u00eda la resistencia. Ninguna de las cepas estudiadas presenta mutaciones en el gen pare. estos resultados sugieren que una mutaci\u00f3n puntual en el gen gyra puede conferir resistencia al \u00e1cido nalid\u00edxico en v. Vulnificus. Adem\u00e1s las cepas que presentan una mutaci\u00f3n en el gen parc presentan una mayor resistencia a las quinolonas y tambi\u00e9n a las fluorquinolonas.   el an\u00e1lisis por hibridaci\u00f3n sustractiva revel\u00f3 que el gen rtxa de v. Vulnificus mostraba una gran variabilidad entre biotipos, resultado posteriormente confirmado por otros estudios (satchell, 2007; lee y cols., 2008b). La toxina rtx de v. Vulnificus pertenece a la familia de las martx (multifunctional autoprocessing repeat-in-toxin, toxinas autoprocesantes multifuncionales con secuencias repetitivas). Estas toxinas se pueden dividir en tres partes claramente diferentes, los extremos n y c terminal (que contienen las secuencias repetitivas) y una regi\u00f3n interna que contiene los distintos dominios funcionales. Los extremos n y c terminal son altamente conservados, tanto dentro de la especie como dentro del g\u00e9nero, resultado que es concordante con la funci\u00f3n propuesta para estas regiones, que es la de interactuar con la membrana de las c\u00e9lulas eucari\u00f3ticas permitiendo la translocaci\u00f3n de los dominios funcionales al citoplasma. Entre los dominios funcionales destaca el dominio cpd, cuya funci\u00f3n es la escisi\u00f3n de la parte interna (autoprocessing) de la prote\u00edna permitiendo la funci\u00f3n del resto de dominios (sheahan y cols., 2007). En total hemos estudiado 8 dominios diferentes, varios de ellos han sido redefinidos en este trabajo en funci\u00f3n de su similitud con otras secuencias conocidas. V. Vulnificus produce tres tipos distintos de martx; los aislados de biotipo 1 muestran dos tipos diferentes de martxvv, el i y el ii; todos los aislados de biotipo 2 presentan el tipo iii y el biotipo 3 presenta el tipo ii. El tipo i coincide con el descrito por satchell (2007); el tipo ii, descrito en este trabajo por primera vez, se diferencia del tipo i por carecer de uno de los dominios (el dominio rtxa pa) y el tipo iii coincide con el tipo descrito por lee y cols. (2008b) en el pl\u00e1smido de virulencia del biotipo 2. En este trabajo tambi\u00e9n hemos encontrado que la copia cromos\u00f3mica del gen rtxa, en las cepas de biotipo 2, es id\u00e9ntica a la plasm\u00eddica y que el biotipo 3 presenta la martxvv tipo ii.   la martxvv es uno de los principales factores de virulencia de v. Vulnificus para humanos, ya que mutaciones en este gen eliminan pr\u00e1cticamente la virulencia para ratones (kim y cols., 2008; lee y cols., 2008a). Las martxvv tipo i y ii han sido ambas detectadas en aislados humanos, y siendo el tipo ii carente del dominio rtxa pa, sugiere que este dominio no es esencial en la virulencia para humanos. Los aislados de biotipo 2 (pat\u00f3genos de peces) muestran la martxvv tipo iii, que podr\u00eda estar relacionado con la virulencia espec\u00edfica para los peces. El papel de los distintos tipos de martxvv en virulencia, as\u00ed como la raz\u00f3n de la duplicaci\u00f3n del gen en el biotipo 2 est\u00e1 todav\u00eda por dilucidar.   el estudio evolutivo de las secuencias de los distintos genes muestra que son mosaicos de fragmentos con diferentes historias evolutivas, lo que se puede ver de manera clara al no ser comparables las historias evolutivas de los genes completos y de los distintos fragmentos. Ninguna de las historias evolutivas obtenidas es equivalente al hipot\u00e9tico escenario evolutivo de la especie (cohen y cols., 2007; bisharat y cols., 2007b). Por ejemplo, el \u00e1rbol filogen\u00e9tico obtenido con el gen completo muestra un escenario evolutivo poco veros\u00edmil a nivel espec\u00edfico, en el que v. Vulnificus forma un grupo compacto con l. Anguillarum y v. Splendidus (ambas \u00edntimamente relacionadas con la cepa riu-1), apareciendo v. Cholerae como un grupo monofil\u00e9tico bien sostenido. Esta situaci\u00f3n puede ser explicada f\u00e1cilmente si el gen, en realidad, es un gen mosaico y, por tanto, se mezclan en \u00e9l historias evolutivas diferentes.  este resultado que muestra a estos genes como mosaicos de fragmentos, es concordante con la pertenencia de los genes martx a la familia de genes \u00absegmentados\u00bb, genes que presentan regiones de secuencia variable intercalada con zonas de secuencia constante. la explicaci\u00f3n m\u00e1s probable para esta compleja historia evolutiva ser\u00eda que, los diferentes dominios han sido adquiridos por fen\u00f3menos de tgh y posterior recombinaci\u00f3n, dando lugar a nuevas combinaciones, que podr\u00edan haber sido favorecidas por selecci\u00f3n. El an\u00e1lisis bioinform\u00e1tico de las secuencias de los dominios revela que ha habido, al menos, dos eventos de tgh que han afectado a los dominios a\/b hidrolasa y cpd y que, probablemente, ha habido un tercer evento afectando al dominio efa\/lifa. el caso de las martx puede ser un ejemplo de fen\u00f3meno evolutivo mediado por pl\u00e1smidos puesto que la toxina martxvv tipo iii, la del biotipo 2, est\u00e1 codificada por duplicado en el cromosoma y en el pl\u00e1smido. Esta situaci\u00f3n podr\u00eda ser explicada por la adquisici\u00f3n de distintos genes mediados y que posteriormente sufrieron fen\u00f3menos de recombinaci\u00f3n llegando a la situaci\u00f3n actual.  muchos investigadores han destinado sus esfuerzos a la b\u00fasqueda de un sistema que permitiera discriminar de forma r\u00e1pida y fiable, los aislados cl\u00ednicos de los ambientales diversos sistemas han sido propuestos para este fin pero ninguno de ellos consegu\u00eda una eficiencia del 100%, fallando sobre todo en los aislados de biotipos 2 y 3 (sanjuan y cols., 2009). Bas\u00e1ndonos en un trabajo previo (sanjuan, 2008), en el que se vio la utilidad potencial del gen pilf, intentamos poner a punto una metodolog\u00eda basada en la pcr que fuera \u00fatil para discriminar los aislados potencialmente pat\u00f3genos para los humanos. El an\u00e1lisis de la secuencia completa de este gen en numerosas cepas, utilizando el m\u00e9todo \u00abneighborn-joining\u00bb, mostr\u00f3 una clara separaci\u00f3n en grupos de las cepas; uno de ellos englobaba a todos los aislados potencialmente pat\u00f3genos para humanos y otro agrupaba al resto de cepas. El an\u00e1lisis de esas secuencias mediante el alineamiento de las mismas puso de manifiesto un regi\u00f3n polim\u00f3rfica de 34 nucle\u00f3tidos, a partir de la cual se pudo dise\u00f1ar una pcr m\u00faltiple que permite diferenciar con una eficiencia de100% aquellas cepas de v. Vulnificus potencialmente peligrosas para la salud p\u00fablica (vvpdh+) de las que no lo son (vvpdh-). Asimismo, corroboramos que la cepa cect529t, pese a estar aislada de sangre, no resiste al suero humano, confirmando as\u00ed lo expuesto por otros autores. (Amako y cols., 1984) y su inclusi\u00f3n en los grupos ambientales por otros estudios (sanjuan y cols., 2009). Igualmente se constat\u00f3 la importancia de la c\u00e1psula para la supervivencia al suero humano (wright y cols., 1990; amaro y cols., 1994; linkous y oliver, 1999; strom y paranjpye, 2000). la utilizaci\u00f3n de esta pcr de forma rutinaria en la industria alimentaria para el estudio de lotes de ostras es factible, ya que se puede realizar la pcr a partir de l\u00edquido intravalvar de modo directo, obteniendo un l\u00edmite de detecci\u00f3n de 4 x 102 ufc\/ml.  por \u00faltimo, se prob\u00f3 la viabilidad del uso de t\u00e9cnicas de tipificaci\u00f3n por pcr, para agrupar los distintos aislados en serotipos, en base a los perfiles obtenidos (pacheco y cols., 1997; albufera y cols., 2009; ishii y sadowsky, 2009). El sistema gtg5-pcr en condiciones restrictivas proporciona perfiles correlacionados con pertenencia de las cepas a las distintas serovariedades, proporcionando una correspondencia del 100% entre perfil y serovariedad, tanto para las cepas de biotipo 2 y 3 (serovariedades o [biotipo 3], a, e e i [biotipo 2]) como para las cepas de biotipo 1, serotipadas con el sistema de inmunotinci\u00f3n del ant\u00edgeno o (serovariedades t, f, w y m) que muestran un perfil diferente para cada una de ellas.  adem\u00e1s bas\u00e1ndonos en lo expuesto por otros autores, este tipo de sistemas permite diferenciar grupos clonales e identificar grupos gen\u00e9ticamente cercanos (vos y cols., 1999; dabo y cols., 1999), con lo cual este sistema nos permitir\u00eda, adem\u00e1s de diferenciar serogrupos en v. Vulnificus, tambi\u00e9n diferenciar grupos clonales. Estos datos nos llevan de nuevo a plantear la hip\u00f3tesis del origen polifil\u00e9tico de los biotipos 1 y 2, ya que esos biotipos aparecen formados por diversos grupos clonales.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudio gen\u00f3mico sobre el pat\u00f3geno vibrio vulnificus<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudio gen\u00f3mico sobre el pat\u00f3geno vibrio vulnificus <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Francisco Jose Roig  Molina <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Universitat de val\u00e9ncia (estudi general)<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 03\/06\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Carmen Amaro Gonz\u00e1lez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Jes\u00fas angel L\u00f3pez romalde <\/li>\n<li>Jos\u00e9 Rafael Penades casanova (vocal)<\/li>\n<li>Ana margarida Trigo de sousa roque (vocal)<\/li>\n<li>Fernando Gonzalez candelas (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Francisco Jose Roig Molina La especie v. 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