{"id":110318,"date":"2018-03-11T10:36:14","date_gmt":"2018-03-11T10:36:14","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/desarrollo-de-metodos-de-deteccion-de-salmonella-basados-en-la-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-y-su-validacion-en-alimentos\/"},"modified":"2018-03-11T10:36:14","modified_gmt":"2018-03-11T10:36:14","slug":"desarrollo-de-metodos-de-deteccion-de-salmonella-basados-en-la-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-y-su-validacion-en-alimentos","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/pais-vasco-euskal-herriko-unibertsitatea\/desarrollo-de-metodos-de-deteccion-de-salmonella-basados-en-la-reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa-y-su-validacion-en-alimentos\/","title":{"rendered":"Desarrollo de m\u00e9todos de detecci\u00f3n de salmonella basados en la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa y su validaci\u00f3n en alimentos"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Ilargi Martinez Ballesteros <\/strong><\/h2>\n<p>Salmonella es uno de los pat\u00f3genos alimentarios m\u00e1s importantes a nivel mundial y causante de enfermedades gastroent\u00e9ricas en humanos y animales. La presencia de salmonella en un alimento, sea en la cantidad que sea, se considera peligroso y por lo tanto no ser\u00e1 apto para el consumo humano. Por ello, los controles microbiol\u00f3gicos rutinarios en la cadena alimentaria son de vital importancia para no comprometer la salud del consumidor. Los controles se deben realizar a lo largo de todo el proceso de elaboraci\u00f3n del alimento, es decir, controlando desde las condiciones implantadas en la granja hasta la calidad del producto final que llegar\u00e1 al consumidor. Tradicionalmente los m\u00e9todos microbiol\u00f3gicos empleados para detectar pat\u00f3genos en los alimentos han sido m\u00e9todos basados en el cultivo. El m\u00e9todo tradicional de detecci\u00f3n de salmonella comprende cuatro fases: una primera fase de preenriquecimiento no selectivo, una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento en medios s\u00f3lidos selectivos, y una \u00faltima fase de confirmaci\u00f3n mediante pruebas bioqu\u00edmicas y serol\u00f3gicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y alargan la obtenci\u00f3n de los resultados hasta una semana. las t\u00e9cnicas moleculares han sido un gran avance de las cuales la microbiolog\u00eda se ha beneficiado para desarrollar m\u00e9todos nuevos de detecci\u00f3n de pat\u00f3genos. Entre ellas, las t\u00e9cnicas basadas en la amplificaci\u00f3n de los \u00e1cidos nucleicos como la pcr (reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa) proporcionan una estrategia r\u00e1pida y sensible para la detecci\u00f3n de pat\u00f3genos. Adem\u00e1s, la mejora que ha supuesto la pcr a tiempo real permite obtener los resultados incluso en menos tiempo y evitar el procesado post-pcr que puede provocar contaminaci\u00f3n cruzada debido a la manipulaci\u00f3n de las muestras. en todo caso, para el desarrollo de m\u00e9todos basados en pcr es esencial la elecci\u00f3n de una diana gen\u00e9tica adecuada a cada pat\u00f3geno que permita dise\u00f1ar t\u00e9cnicas totalmente espec\u00edficas de la bacteria que se quiera detectar en cada caso. el objetivo principal de este trabajo fue crear m\u00e9todos de detecci\u00f3n de salmonella basados en la pcr que facilitasen y disminuyesen el tiempo requerido para la obtenci\u00f3n de los resultados. Para ello se cumplieron las siguientes etapas: i) elecci\u00f3n de una diana gen\u00e9tica espec\u00edfica de salmonella, ii) desarrollo de una pcr para el diagn\u00f3stico de salmonella, iii) desarrollo de sistemas de pcr a tiempo real para detecci\u00f3n de salmonella, iv) validaci\u00f3n de los m\u00e9todos de pcr a tiempo real dise\u00f1ados frente al m\u00e9todo tradicional de detecci\u00f3n de salmonella en muestras de alimentos. en primer lugar se estudiaron diferentes genes propuestos por diversos autores como dianas gen\u00e9ticas de salmonella. Tras realizar diversas reacciones de pcr con las parejas de iniciadores correspondientes, se estableci\u00f3 que el gen m\u00e1s adecuado para utilizar como diana gen\u00e9tica de salmonella en m\u00e9todos de pcr era el gen inva. La prote\u00edna codificada por este gen pertenece a un sistema de secreci\u00f3n totalmente necesario para causar la invasi\u00f3n bacteriana de las c\u00e9lulas epiteliales del intestino. Al ser un gen involucrado con la virulencia de salmonella, presuntivamente estar\u00e1 en todos los aislamientos de salmonella, o por lo menos, en todas las cepas virulentas. una vez elegido el gen inva como diana gen\u00e9tica espec\u00edfica de salmonella se dise\u00f1\u00f3 una pcr, utilizando los mismos iniciadores descritos anteriormente por rahn k y colaboradores (1992), a la cual se a\u00f1adi\u00f3 un control interno de amplificaci\u00f3n dise\u00f1ado espec\u00edficamente en este trabajo. La incorporaci\u00f3n de controles internos de amplificaci\u00f3n a los m\u00e9todos de pcr es esencial para detectar posibles inhibiciones en las reacciones de pcr, causadas principalmente por componentes presentes en los alimentos. Las 40 cepas de salmonella analizadas mediante esta pcr mostraron un resultado positivo para la amplificaci\u00f3n del gen inva, mientras que todos los aislamientos analizados de microorganismos relacionados con esa bacteria fueron negativos. con la intenci\u00f3n de disminuir aun m\u00e1s los tiempos de obtenci\u00f3n de resultados, se decidi\u00f3 adaptar esa pcr a un formato de pcr a tiempo real. Existen diferentes sistemas de detecci\u00f3n utilizados en pcr a tiempo real. En este trabajo se eligi\u00f3 dise\u00f1ar por un lado una pcr utilizando sondas taqman\u00c2\u00ae como sistema detecci\u00f3n, y por otro lado una pcr a tiempo real utilizando sybr green i. En la pcr a tiempo real con sybr green i los iniciadores utilizados fueron los mismos que para la pcr convencional, pero se dise\u00f1\u00f3 un nuevo control interno adecuado para la pcr a tiempo real. Sin embargo, para la pcr a tiempo real con sonda se dise\u00f1aron unos nuevos iniciadores y una sonda que hibridase espec\u00edficamente con el fragmento amplificado por esos iniciadores, adem\u00e1s de un nuevo control interno que fuese detectado mediante otra sonda adicional marcada con un fluor\u00f3foro diferente. La especificidad de ambas reacciones de pcr a tiempo real fue probada tanto de forma te\u00f3rica mediante programas inform\u00e1ticos como de manera experimental. La tecnolog\u00eda con sondas taqman\u00c2\u00ae result\u00f3 ser m\u00e1s sensible que la tecnolog\u00eda sybr green i en este estudio, aunque por otro lado, la ausencia de reacci\u00f3n de la sonda con una de las cepas de salmonella analizadas indic\u00f3 que esa tecnolog\u00eda era a su vez menos espec\u00edfica que el sybr green i. los m\u00e9todos de pcr a tiempo real fueron comparados frente al m\u00e9todo tradicional de detecci\u00f3n de salmonella en diferentes muestras de alimentos. Para realizar esta validaci\u00f3n se sigui\u00f3 lo descrito en la norma iso 16140:2003. Se calcularon tanto la inclusividad y exclusividad de los m\u00e9todos, as\u00ed como la eficacia relativa, especificidad relativa y sensibilidad relativa de los m\u00e9todos moleculares, y tambi\u00e9n el nivel de detecci\u00f3n relativa de \u00e9stos. En la pcr a tiempo real con sonda taqman\u00c2\u00ae se utilizaron dos master mix comerciales diferentes (una master mix de takara y otra de applied biosystems) con el fin de analizar tambi\u00e9n la influencia que ejerce la master mix empleada en los resultados. Para el c\u00e1lculo de la inclusividad se utilizaron 50 aislamientos diferentes de salmonella seg\u00fan lo indicado en la citada norma iso, obteniendo para todos ellos un resultado positivo para la detecci\u00f3n del gen inva. Para el test de exclusividad se analizaron 30 cepas de microorganismos relacionados con salmonella, los cuales mostraron un resultado negativo en las reacciones de amplificaci\u00f3n. Para el c\u00e1lculo de la eficacia, especificidad y sensibilidad relativas se utilizaron 309 muestras de alimentos diferentes seg\u00fan las categor\u00edas alimentarias descrita en la norma iso. para obtener una amplia variedad de resultados positivos y negativos, aproximadamente la mitad de esas 309 muestras de alimentos fueron contaminadas artificialmente con salmonella. Se obtuvieron unos valores comprendidos entre 80%-100%, excepto en la sensibilidad relativa de la pcr a tiempo real con sonda utilizando la master mix de applied biosystems que fue del 62,4%. Los niveles de detecci\u00f3n relativa se calcularon seg\u00fan lo descrito en la norma iso para cinco alimentos diferentes (uno de cada categor\u00eda alimentaria), utilizando para cada alimento 5 o 6 niveles de contaminaci\u00f3n. Los resultados obtenidos abarcaron un rango de 0,1-10 c\u00e9lulas\/25gr de alimento. Excepto en la pcr a tiempo real con sonda en la cual el l\u00edmite de detecci\u00f3n en muestras de pescado fue de alrededor de 100 c\u00e9lulas\/25gr. a lo largo de todo el an\u00e1lisis realizado en alimentos se identificaron diferentes etapas que se consideraron cr\u00edticas a la hora de emplear m\u00e9todos moleculares para la detecci\u00f3n de pat\u00f3genos en alimentos. Uno de los principales problemas surgidos fue la influencia que ejerc\u00eda la composici\u00f3n del alimento a lo largo de todo el proceso. Los mayores problemas se detectaron en los alimentos con un alto contenido en grasa, dado que la grasa influye notablemente en la capacidad de detecci\u00f3n de los m\u00e9todos moleculares. Otro de los puntos cr\u00edticos fue el m\u00e9todo de extracci\u00f3n de adn, que puede influir en la concentraci\u00f3n del adn recuperado y en su calidad. Por todo ello, y al no existir un protocolo universal de procesamiento de las muestras previo a las reacciones de pcr, se debe optimizar cada m\u00e9todo de an\u00e1lisis teniendo en cuenta el alimento que se debe analizar y el pat\u00f3geno que se quiere detectar, y amoldarlo a las circunstancias especiales de cada laboratorio<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Desarrollo de m\u00e9todos de detecci\u00f3n de salmonella basados en la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa y su validaci\u00f3n en alimentos<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Desarrollo de m\u00e9todos de detecci\u00f3n de salmonella basados en la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa y su validaci\u00f3n en alimentos <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Ilargi Martinez Ballesteros <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 15\/07\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Joseba Bikandi Bikandi<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: ramon Cisterna cancer <\/li>\n<li>david Rodriguez lazaro (vocal)<\/li>\n<li>silvia Herrera leon (vocal)<\/li>\n<li>jordi Vila estape (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Ilargi Martinez Ballesteros Salmonella es uno de los pat\u00f3genos alimentarios m\u00e1s importantes a nivel mundial y causante 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