{"id":110363,"date":"2018-03-11T10:36:19","date_gmt":"2018-03-11T10:36:19","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/purificacion-caracterizacion-y-expresion-heterologa-de-la-proteasa-menor-extracelular-epr-de-bacillus-licheniformis\/"},"modified":"2018-03-11T10:36:19","modified_gmt":"2018-03-11T10:36:19","slug":"purificacion-caracterizacion-y-expresion-heterologa-de-la-proteasa-menor-extracelular-epr-de-bacillus-licheniformis","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/santiago-de-compostela\/purificacion-caracterizacion-y-expresion-heterologa-de-la-proteasa-menor-extracelular-epr-de-bacillus-licheniformis\/","title":{"rendered":"Purificaci\u00f3n, caracterizaci\u00f3n y expresi\u00f3n heter\u00f3loga de la proteasa menor extracelular (epr) de bacillus licheniformis"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Jos\u00e9 Manuel Ageitos Mart\u00ednez <\/strong><\/h2>\n<p>La cepa b. Licheniformis usc13 aislada en nuestro laboratorio tiene la capacidad de producir un enzima que coagula la leche de modo natural. Guiados por el objetivo de conseguir nuevas fuentes de enzimas con aplicaci\u00f3n a la industria de la queser\u00eda, se decidi\u00f3 estudiar y caracterizar este enzima de inter\u00e9s. Los estudios llevados a cabo permitieron establecer que el enzima responsable de este efecto es la proteasa menor extracelular (epr). la proteasa epr es una de las proteasas expresadas durante la fase estacionaria de crecimiento en b. Subtilis, representando un 2-4% del porcentaje total de proteasas durante de esa fase, este enzima pertenece a la familia de peptidasas s8. No es necesaria para el crecimiento o la esporulaci\u00f3n. Su expresi\u00f3n se ve inhibida catab\u00f3licamente por la acci\u00f3n de reguladores de estado de transici\u00f3n. Enzim\u00e1ticamente, esta proteasa presenta inhibici\u00f3n por pmsf y, a pesar de no ser una metaloproteasa, es inhibida ante concentraciones elevadas de edta. Esta proteasa estar relacionada con el procesamiento de un factor de competencia implicado en el qu\u00f3rum sensing. esta proteasa se expresa con una regi\u00f3n inicial que funciona como chaperona y como un dominio inhibitorio (i9). Los inhibidores de peptidasas de esta familia pueden encontrarse como un dominio simple en la prote\u00edna, o bien como dominios simples o m\u00faltiples que no se encuentran dentro de una prote\u00edna. En muchos casos son sintetizados como parte de una prote\u00edna precursora m\u00e1s larga, tanto como un preprop\u00e9ptido o como un dominio n-terminal asociado con la peptidasa inactiva. el mecanismo de acci\u00f3n de estos inhibidores es variado, algunos inhibidores interact\u00faan directamente con las proteasas utilizando un sistema de cierre no covalente y un mecanismo de llave; otros inhibidores utilizan un sistema de cambio de conformaci\u00f3n que altera su estructura y propiedades termodin\u00e1micas. la expresi\u00f3n de la proteasa epr en b. Subtilis est\u00e1 regulada por el promotor \u00c2\u00bfd. Este promotor regula la motilidad y la producci\u00f3n de autolisinas implicadas en la separaci\u00f3n celular y el mantenimiento de la heterogeneidad . La \u00c2\u00bfproteasa menor extracelular\u00c2\u00bf epr se expresa en forma de preprop\u00e9ptido, con un p\u00e9ptido se\u00f1al sec (ps) de 27 anino\u00e1cidos. para poder estudiar este enzima se desarrollo un m\u00e9todo de medici\u00f3n de actividad coagulante que permitiese realizar estudios cin\u00e9ticos y de estabilidad. El m\u00e9todo tradicional para evaluar un enzima coagulante es su incubaci\u00f3n frente a leche. La coagulaci\u00f3n de la leche es un fen\u00f3meno que se ve afectada por el ph y la temperatura, produci\u00e9ndose de forma espontanea baja determinadas condiciones (ph bajo o elevadas temperaturas). Otro de los problemas que tiene esta determinaci\u00f3n es que no es adecuada para enzimas que no tengan una actividad elevada, puesto que se determina el tiempo que se tarda en coagular, produci\u00e9ndose muchas veces la coagulaci\u00f3n incluso de los controles negativos. Por \u00faltimo, cabe destacar, que para el estudio de los par\u00e1metros cin\u00e9ticos, es necesario utilizar diferentes concentraciones de sustrato, y en la coagulaci\u00f3n de la leche es dependiente de la cantidad de sustrato. De este modo, no se producir\u00e1 la coagulaci\u00f3n en muestras de leche diluidas, dado que es necesario que las micelas de la leche se encuentren agregadas para que este proceso se d\u00e9 lugar. El m\u00e9todo propuesto, que dio lugar a una patente de la usc, se basa en la medici\u00f3n de la fluorescencia liberada por la degradaci\u00f3n de la k-case\u00edna marcada con isotiocianato de fluoresce\u00edna. los niveles de expresi\u00f3n del microorganismo de origen no son lo sufrientemente elevadas como para su uso directo. Adem\u00e1s la producci\u00f3n de este enzima se ve acompa\u00f1ada por la de otros enzimas que producen la degradaci\u00f3n de la masa quesera y olores desagradables. Se desarrollo una metodolog\u00eda para purificar el enzima y permitir su uso. el gen fue aislado y clonado en el vector pcr-bluntii topo, y de ah\u00ed se moviliz\u00f3 al vector de expresi\u00f3n pet30a. Esta construcci\u00f3n se expres\u00f3 en la cepa bl21(de3) de e. Coli. Se consiguieron niveles de sobre expresi\u00f3n en bacteria, pero no se consigui\u00f3 que las muestras tuviesen actividad significativa. La mayor parte de la proteasa expresada se acumul\u00f3 en cuerpos de inclusi\u00f3n intracelulares, la purificaci\u00f3n y solubilizaci\u00f3n de los mismos no consigui\u00f3 la obtenci\u00f3n de enzima activa. Se utilizaron diferentes estrategias para intentar aumentar la cantidad de enzima soluble. Para ello se realizaron expresiones a diferentes temperaturas, tiempos y concentraciones del inductor. Se pudo observar que la cantidad de proteasa soluble aumenta cuando la temperatura de expresi\u00f3n se baja. Del mismo modo, se pudo observar que a 37\u00c2\u00ba c la banda de expresi\u00f3n del enzima se desdobla en dos bandas, posiblemente por prote\u00f3lisis de la muestra. para la estrategia de expresi\u00f3n en levadura la construcci\u00f3n se moviliz\u00f3 al vector de expresi\u00f3n phils1 de p. Pastoris. Los estudios de expresi\u00f3n inducible con metanol consiguieron la producci\u00f3n de enzima activa, pero esta no lleg\u00f3 a acumularse por un proceso de prote\u00f3lisis. Este mismo resultado se pudo observar en la expresi\u00f3n de otros enzimas coagulantes se realiz\u00f3 un estudio de modelado tridimensional de la estructura de la proteasa, llegando a la conclusi\u00f3n que el calcio representaba un papel fundamental, bien en el plegado o en la activaci\u00f3n del enzima. Los estudios realizados en las muestras de cuerpos de inclusi\u00f3n tratados con calcio permiti\u00f3 la activaci\u00f3n de enzima. Se pudo determinar que la activaci\u00f3n del enzima requiere calcio, pero este no es adecuado para el plegado de la estructura, los estudios determinaron que el enzima sufre una p\u00e9rdida de actividad cuando no tiene otro sustrato sobre el que actuar. El calcio que estabiliza la estructura del modelo de la proteasa produce que la regi\u00f3n i9 se adentre en el centro activo de la proteasa durante la minimizaci\u00f3n del modelo. Se podr\u00eda considerar que el modelo representa a la proepr en el momento de la activaci\u00f3n, puesto que la regi\u00f3n i9 se encuentra dentro del centro activo, con lo que tender\u00eda a cortarse. El calcio representar\u00eda un nuevo nivel de control para la activaci\u00f3n de este enzima, no encontr\u00e1ndose cantidades tan elevadas de calcio m\u00e1s que en la regi\u00f3n \u00c2\u00bfperipl\u00e1smica\u00c2\u00bf, estando controlada por los niveles de \u00e1cido dipicolico, un quelante natural del calcio. el enzima epr produce las masas queseras a partir de diferentes tipos de leche. Las masas queseras obtenidas con el enzima recombinante tienen unos patrones de prote\u00edna y grasa diferentes a las que presentan los enzimas comerciales y similares a las que presenta el enzima natural, si bien el proceso de coagulaci\u00f3n sigue siendo lento. Los mejores resultados se obtuvieron al utilizar el enzima epr y quimosina, siendo, en todos los aspectos, superiores a los controles y a las masas queseras obtenidas exclusivamente con el enzima recombinante. Con este uso combinado se obtienen unas masas queseras con unas mejores caracter\u00edsticas y con una coagulaci\u00f3n r\u00e1pida. En un proceso industrial se deber\u00eda incubar previamente la leche con la proteasa epr y utilizar la quimosina como coagulante final.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Purificaci\u00f3n, caracterizaci\u00f3n y expresi\u00f3n heter\u00f3loga de la proteasa menor extracelular (epr) de bacillus licheniformis<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Purificaci\u00f3n, caracterizaci\u00f3n y expresi\u00f3n heter\u00f3loga de la proteasa menor extracelular (epr) de bacillus licheniformis <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Jos\u00e9 Manuel Ageitos Mart\u00ednez <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 18\/07\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Margarita Poza Dom\u00ednguez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: \u00e1ngel Dom\u00ednguez olavarri <\/li>\n<li>Jos\u00e9 pedro Martinez garcia (vocal)<\/li>\n<li>Miguel Vi\u00f1as ciordia (vocal)<\/li>\n<li>Mar\u00eda no Gacto fern\u00e1ndez (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Jos\u00e9 Manuel Ageitos Mart\u00ednez La cepa b. 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