{"id":110535,"date":"2018-03-11T10:36:35","date_gmt":"2018-03-11T10:36:35","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/desarrollo-de-metodos-de-pcr-convencional-para-la-deteccion-de-mohos-productores-de-micotoxinas-en-alimentos\/"},"modified":"2018-03-11T10:36:35","modified_gmt":"2018-03-11T10:36:35","slug":"desarrollo-de-metodos-de-pcr-convencional-para-la-deteccion-de-mohos-productores-de-micotoxinas-en-alimentos","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/extremadura\/desarrollo-de-metodos-de-pcr-convencional-para-la-deteccion-de-mohos-productores-de-micotoxinas-en-alimentos\/","title":{"rendered":"Desarrollo de m\u00e9todos de pcr convencional para la detecci\u00f3n de mohos productores de micotoxinas en alimentos"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Mar\u00eda  Isabel Luque Caballero <\/strong><\/h2>\n<p>En la superficie de alimentos, se desarrolla una abundante poblaci\u00f3n de mohos entre los que predominan especies pertenecientes a los g\u00e9neros penicillium y aspergillus. Estas y otras especies de mohos producen metabolitos secundarios, como las aflatoxinas, ocratoxina a y patulina. Estas micotoxinas tienen propiedades toxig\u00e9nicas, teratog\u00e9nicas y carcin\u00f3genicas. Para evitar la presencia de los mohos productores de estas micotoxinas en alimentos es necesario contar con m\u00e9todos que permitan detectar cepas productoras.   la detecci\u00f3n de mohos potencialmente toxig\u00e9nicos puede realizarse utilizando m\u00e9todos convencionales de aislamiento, cultivo del moho y evaluaci\u00f3n de la producci\u00f3n de la micotoxina. Este procedimiento es laborioso y consume mucho tiempo de an\u00e1lisis, por lo que dificulta su uso como t\u00e9cnica rutinaria de an\u00e1lisis. Una alternativa a este tipo de m\u00e9todos es el dise\u00f1o de protocolos de pcr que permitan la detecci\u00f3n de los mohos productores de aflatoxinas, ota y patulina por individual y simult\u00e1neamente. Para el dise\u00f1o de este tipo de m\u00e9todos hay que tener en cuenta que se conocen los enzimas que intervienen en la bios\u00edntesis y los genes que codifican a las aflatoxinas, ota y patulina,  pero \u00fanicamente han sido estudiadas las dos especies de mayor potencial aflatoxig\u00e9nico en el caso de las aflatoxinas y las especies mayormente conocidas de penicillium, en el caso de ota y patulina, por lo que deben abordarse diferentes protocolos de pcr ensayando con las secuencias relacionadas con la s\u00edntesis de las mismas, capaces de detectar mohos potencialmente toxig\u00e9nicos pertenecientes a diversos g\u00e9neros. El objetivo de este trabajo fue encontrar secuencias relacionadas con la s\u00edntesis de aflatoxinas, ota y patulina a partir de las cuales desarrollar m\u00e9todos de pcr para la detecci\u00f3n espec\u00edfica de mohos productores de estas micotoxinas pertenecientes a los distintos g\u00e9neros. Para el desarrollo de este trabajo se han utilizado 64 cepas pertenecientes a diferentes colecciones de cultivos tipo y diferentes aislados de mohos procedentes de productos c\u00e1rnicos madurados. Se ha evaluado la producci\u00f3n de aflatoxinas, ota y patulina de estas cepas y de los aislados en agar extracto de malta (cepas productoras de patulina) y en pda (cepas aflatoxig\u00e9nicas y ocratoxig\u00e9nicas) utilizando los m\u00e9todos cualitativos tlc, mecc y hplc-ms. La t\u00e9cnica de tlc no permite la detecci\u00f3n sensible de las cepas productoras. Mediante mecc y hplc-ms se confirm\u00f3 la producci\u00f3n de aflatoxinas, ota y patulina en gran parte de las cepas consideradas como productoras y en otras de las cepas en las que no se dispon\u00eda de informaci\u00f3n en la correspondiente colecci\u00f3n de cultivo. Todas las cepas que produjeron aflatoxinas, ota \u00f3 patulina, respectivamente, fueron consideradas como productoras y, previamente confirmadas mediante cada uno de los m\u00e9todos de pcr desarrollados con cebadores espec\u00edficos dise\u00f1ados, para la detecci\u00f3n de mohos productores de estas micotoxinas. Utilizando cepas de la colecci\u00f3n al azar, confirmadas previamente por t\u00e9cnicas anal\u00edticas como productoras, se desarrollaron varios protocolos de pcr para la detecci\u00f3n de mohos productores de aflatoxinas, ota y patulina, de manera individual, y posteriormente, se desarroll\u00f3 un m\u00e9todo de pcr m\u00faltiple para la detecci\u00f3n simult\u00e1nea de mohos productores de estas micotoxinas. Estos protocolos fueron ensayados tanto con adn gen\u00f3mico como con adn de mohos extra\u00eddo directamente, sin necesidad de previa incubaci\u00f3n, de alimentos contaminados. para la detecci\u00f3n de mohos aflatoxig\u00e9nicos, se abord\u00f3 el an\u00e1lisis de secuencias conocidas de genes que regulan la s\u00edntesis de estas micotoxinas (aflr, c2, nor-1, apa,  ver-1 y omt-1). Para la detecci\u00f3n de mohos ocratoxig\u00e9nicos, se probaron secuencias de los genes otapkspn y otanpspn y, para la detecci\u00f3n de mohos productores de patulina, secuencias de genes que regulan la s\u00edntesis de la patulina (pef, idh e iao). de todas las v\u00edas probadas, los m\u00e9todos de pcr llevados a cabo con secuencias de cebadores basados en los genes omt-1, otanpspn e idh, responsables de las rutas biosint\u00e9ticas de las aflatoxinas, ota y patulina, respectivamente, fueron los m\u00e1s adecuados para la detecci\u00f3n de cepas micotoxig\u00e9nicas pertenecientes a los diversos g\u00e9neros de mohos incluidos en este estudio. Tras la purificaci\u00f3n y secuenciaci\u00f3n de los productos de pcr amplificados resultantes con los m\u00e9todos de pcr ensayados, se encontraron secuencias a partir de las cuales se dise\u00f1aron cebadores espec\u00edficos y m\u00e9todos de pcr convencional. Finalmente, se detectaron amplicones de 381 pb, 520 y 496 pb correspondientes a cepas productoras de aflatoxinas, ota y patulina en especies toxig\u00e9nicas de diversos g\u00e9neros, mediante los m\u00e9todos de pcr optimizados con los cebadores aff1\/afr3, f1ot\/r1ot y fc2\/idh2, respectivamente. los m\u00e9todos de pcr desarrollaros demostraron ser sensibles y espec\u00edficos capaces de detectar concentraciones de adn de cepas productoras de aflatoxinas, ota y patulina por debajo de 15 pg, 25 ng y 0.5 ng, respectivamente. Igualmente, la especificidad de estos m\u00e9todos fue demostrada al detectar peque\u00f1as concentraciones de las cepas productoras a\u00fan en presencia de elevadas concentraciones de cepas no toxig\u00e9nicas, aunque como era de esperar, la intensidad del producto de pcr amplificado era ligeramente menor, posiblemente por competici\u00f3n del adn inespec\u00edfico. Adem\u00e1s, a diferencia de otros trabajos que alcanzaron valores pr\u00f3ximos de sensibilidad, con los m\u00e9todos de pcr dise\u00f1ados en este trabajo, se pudo detectar diferentes g\u00e9neros y especies de mohos toxig\u00e9nicos empleando para ello una \u00fanica pareja de cebadores y un protocolo de pcr. los protocolos de pcr dise\u00f1ados fueron tambi\u00e9n ensayados empleando adn de mohos toxig\u00e9nicos artificialmente inoculados en alimentos, alcanz\u00e1ndose l\u00edmites de detecci\u00f3n de 102-104 ufc\/g. Esto demuestra la importancia y sensibilidad de los m\u00e9todos de pcr elaborados, ya que se alcanzaron valores de sensibilidad iguales o menores que los descritos por otros autores para la detecci\u00f3n de una especie determinada y con previa incubaci\u00f3n de la muestra. Sin embargo, los m\u00e9todos dise\u00f1ados en este estudio, detectaron hasta niveles bajos de contaminaci\u00f3n por mohos toxig\u00e9nicos, en una amplia variedad de alimentos, sin necesidad de incubaci\u00f3n previa de las muestras y detectando especies toxig\u00e9nicas pertenecientes a diversos g\u00e9neros de mohos.  por \u00faltimo, se llevaron a cabo ensayos de inhibici\u00f3n por parte de los componentes propios de las matrices alimentarias, demostrando que aquellos alimentos que pose\u00edan mayor contenido graso, proteico y de polifenoles, mostraron inhibici\u00f3n al realizar las pcr en presencia de elevadas cantidades de adn de alimento no inoculados, ya que estos componentes afectan a la calidad de extracci\u00f3n del adn y, consecuentemente, a la amplificaci\u00f3n de la pcr. para evitar la necesidad de aplicar un protocolo de pcr convencional para la detecci\u00f3n de mohos productores de cada una de las micotoxinas, se desarroll\u00f3 un m\u00e9todo de pcr m\u00faltiple en el que, combinando tres parejas de cebadores dise\u00f1ados basados en los genes omt-1, otanpspn e idh en una misma reacci\u00f3n y protocolo de pcr m\u00faltiple, se lograron amplificar tres bandas simult\u00e1neamente correspondientes a la producci\u00f3n de aflatoxinas, ota y patulina, alcanz\u00e1ndose l\u00edmites de detecci\u00f3n del orden de 1 ng al emplear adn gen\u00f3mico y de 103-105 ufc\/g al usar adn de las tres especies de mohos micotoxig\u00e9nicas extra\u00eddas de los alimentos contaminados. La importancia de este m\u00e9todo recae en que ning\u00fan m\u00e9todo de pcr m\u00faltiple descrito ha sido capaz de detectar las principales especies productoras de aflatoxinas, ota y patulina al mismo tiempo, detect\u00e1ndose diferentes g\u00e9neros y especies con un \u00fanico set de cebadores y un \u00fanico protocolo de pcr. en conclusi\u00f3n, los m\u00e9todos de pcr simples y m\u00faltiple desarrollados, debido a su rapidez, sensibilidad y especificidad demostrada, deber\u00edan ser considerados como herramientas \u00fatiles a acoplar a los rutinarios sistemas de appcc de las industrias alimentarias, con el fin de asegurar la calidad de los alimentos y, por tanto, la salud de los consumidores.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Desarrollo de m\u00e9todos de pcr convencional para la detecci\u00f3n de mohos productores de micotoxinas en alimentos<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Desarrollo de m\u00e9todos de pcr convencional para la detecci\u00f3n de mohos productores de micotoxinas en alimentos <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Mar\u00eda  Isabel Luque Caballero <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Extremadura<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 22\/07\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Juan  Jose Cordoba Ramos<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: rafael Jordano salinas <\/li>\n<li>agustin Ari\u00f1o moneva (vocal)<\/li>\n<li>M\u00aa del mar Rodr\u00edguez jovita (vocal)<\/li>\n<li>teresa Garcia lacarra (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Mar\u00eda Isabel Luque Caballero En la superficie de alimentos, se desarrolla una abundante poblaci\u00f3n de mohos entre 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