{"id":111123,"date":"2018-03-11T10:37:31","date_gmt":"2018-03-11T10:37:31","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudios-funcionales-de-un-nuevo-inhibidor-del-enzima-de-conjugacion-de-ubiquitinas-ubc13-y-de-la-ubiqa%c2%bcitina-ligasa-rnf8-con-enfasis-en-su-papel-en-la-respuesta-al-dano-al-dna\/"},"modified":"2018-03-11T10:37:31","modified_gmt":"2018-03-11T10:37:31","slug":"estudios-funcionales-de-un-nuevo-inhibidor-del-enzima-de-conjugacion-de-ubiquitinas-ubc13-y-de-la-ubiqa%c2%bcitina-ligasa-rnf8-con-enfasis-en-su-papel-en-la-respuesta-al-dano-al-dna","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/barcelona\/estudios-funcionales-de-un-nuevo-inhibidor-del-enzima-de-conjugacion-de-ubiquitinas-ubc13-y-de-la-ubiqa%c2%bcitina-ligasa-rnf8-con-enfasis-en-su-papel-en-la-respuesta-al-dano-al-dna\/","title":{"rendered":"Estudios funcionales de un nuevo inhibidor del enzima de conjugaci\u00f3n de ubiquitinas ubc13 y de la ubiq\u00c1\u00bcitina ligasa rnf8, con \u00e9nfasis en su papel en la respuesta al da\u00f1o al dna"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Marta Guerra Rebollo <\/strong><\/h2>\n<p>El laboratorio de t. Thomson ha desarrollado de novo peque\u00f1os compuestos capaces de interferir en la interacci\u00f3n entre ubc13 y uev1, inhibiendo su actividad enzim\u00e1tica in vitro e in vivo. En c\u00e9lulas de mam\u00edfero, estos compuestos inhiben la poliubiquitilaci\u00f3n a trav\u00e9s de la lys63 de pcna as\u00ed como la activaci\u00f3n de nf-b por tnf. Estos son los primeros compuestos farmacol\u00f3gicos conocidos capaces de inhibir poliubiquitilaci\u00f3n no-can\u00f3nica, y hemos demostrado que presentan una actividad selectiva y efectos biol\u00f3gicos significativos, con potencialidad terap\u00e9utica. El m\u00e1s activo de estos compuestos ha sido denominado varubin. Para comprobar el efecto de varubin sobre la reparaci\u00f3n translesional de dna tras da\u00f1os genot\u00f3xicos, se realizaron ensayos de ubiquitinaci\u00f3n (a trav\u00e9s de la lys 63 de la ubiquitina) in vivo de pcna en ausencia y presencia de varubin y se analizaron los posibles efectos funcionales de esta inhibici\u00f3n. Con tal de estudiar el efecto de varubin en la ruta de reparaci\u00f3n de rotura de doble cadena del adn, se pretrataron c\u00e9lulas hela y u2os con diferentes concentraciones de varubin y se realiz\u00f3 da\u00f1o en el dna mediante irradiaci\u00f3n gamma, las c\u00e9lulas se fijaron en varios tiempos tras la irradiaci\u00f3n y se realizaron inmunocitoqu\u00edmicas con anticuerpos contra varias proteinas implicadas en esta ruta (p-h2ax, 53bp1, rap80, etc). Para evaluar la capacidad de crecimiento tumoral in vivo se implantaron c\u00e9lulas pc-3\/luc (que integran y expresan constitutivamente el gen de luciferasa) en pr\u00f3statas de ratones nu\/nu, y se seguir\u00e1 su crecimiento y capacidad invasiva en tiempo real con c\u00e1maras ccd. Para determinar el posible efecto de varubin en el proceso de neoangiog\u00e9nesis asociada a tumores se realizaron ensayos de angiog\u00e9nesis in vitro utilizando el ensayo de formaci\u00f3n de t\u00fabulos por c\u00e9lulas huvec cultivadas sobre matrigel (gfp) suplementado con vegf, con o sin varubin. Con tal de evaluar la capacidad invasiva in vitro de c\u00e9lulas tumorales humanas se hicieron ensayos de invasi\u00f3n in vitro en c\u00e1maras de boyden (transwell) recubiertas de matrigel. Varubin inhibe la actividad enzim\u00e1tica del heterod\u00edmero ubc13-uev in vitro e in vivo, inhibiendo de una manera dosis dependiente la activaci\u00f3n de nf-\u00c2\u00bfb por tnf-\u00c2\u00bf y la la poliubiquitilaci\u00f3n de pcna v\u00eda lys63. Varubin sensibiliza a c\u00e9lulas tumorales epiteliales a los efectos antiproliferativos de compuestos como la doxorrubicina o el etop\u00f3sido. Por el contrario, tiene poca actividad sensibilizante, o es protectora, de c\u00e9lulas de origen hematopoy\u00e9tico a los efectos citot\u00f3xicos de agentes genot\u00f3xicos. Varubin muestra actividad antitumoral en un modelo murino de xenoinjerto tumoral de c\u00e1ncer de pr\u00f3stata.  en otra l\u00ednia de investigaci\u00f3n y mediante un estudio enfocado a buscar ubiquitina ligasas que interaccionaran con ubc13-uev se encontr\u00f3 la proteina rnf8. Rnf8 posee 2 dominios functionales: un dominio fha y un dominio ring finger.  Mediante su dominio ring finger, rnf8 recluta enzimas de conjugaci\u00f3n de ubiquitinas. Recientemente, se ha demostrado que rnf8 es crucial en la formaci\u00f3n de foci de reparaci\u00f3n del dna en respuesta a da\u00f1os genot\u00f3xicos. Asimismo, se le supone, aunque a\u00fan no se ha demostrado claramente, un papel en la activaci\u00f3n del checkpoint de ciclo celular en respuesta a dichos da\u00f1os. Para desarrollar este objetivo se utilizaron l\u00edneas celulares hela con integraci\u00f3n estable de pl\u00e1smidos de expresi\u00f3n inducible de rnf8 por tetraciclina (tet-on) con un tag de hemaglutinina (ha). Y l\u00edneas establemente deplecionadas para rnf8 (infecci\u00f3n de lentivirus para la expresi\u00f3n de shrna) en c\u00e9lulas hela, pc3m, mcf7 y du145. Para estudiar las funciones de rnf8 en ciclo celular y en la activaci\u00f3n de checkpoints, se utilizaron tanto las l\u00ednas de sobreexpresi\u00f3n como las de infraexpresi\u00f3n y se realizaron experimentos de bloqueo y liberaci\u00f3n en diferentes fases del ciclo celular (g1 utilizando el doble bloqueo con timidina, o en g2\/m utilizando el bloqueo con nocodazol) que se analizaron mediante citometria de flujo. Tambi\u00e9n se realizaron experimentos de inmunocitoqu\u00edmica con diversos macadores de fases del ciclo (ciclinas a, b, etc) o tubulina con tal de determinar si hay una acumulaci\u00f3n en alguna fase determinada del ciclo en ausencia o sobreexpresi\u00f3n de rnf8. La sobreexpresi\u00f3n de rnf8 causa la acumulaci\u00f3n de c\u00e9lulas en mitosis provocando anomal\u00edas en la funci\u00f3n del huso mit\u00f3tico para tensar, alinear y segregar cromosomas. La depleci\u00f3n de rnf8 produce aumento de c\u00e9lulas en g1 y una disminuci\u00f3n de las c\u00e9lulas en s adem\u00e1s de un retraso en la salida del bloqueo con nocodazol, asociado a una menor degradaci\u00f3n de la ciclina b1.  a partir de resultados previos de un ensayo de yeast two hybrid se confirm\u00f3 la interacci\u00f3n de rnf8 con varios de los candidatos mediante experimentos de coinmunoprecipitaci\u00f3n y western blotting, inmunocitoqu\u00edmica para observar colocalizaciones y se realizaron mutantes tanto en rnf8 como en los candidatos para determinar los dominios responsables de la interacci\u00f3n. Partiendo de la observaci\u00f3n previa en la que rnf8 se localiza en nucleolo y en foci nucleares en ausencia de da\u00f1o genot\u00f3xico, y que estos foci no corresponden a sitios de rotura espont\u00e1nea del dna, se realizaron experimentos de inmunocitoqu\u00edmica para intentar encontrar otras prote\u00ednas que tambi\u00e9n se localizan en estos foci. Rnf8 interacciona con rpsa a trav\u00e9s del dominio fha. La treonina 223 de rpsa aunque relevante para la interacci\u00f3n, no descarta la implicaci\u00f3n de otros residuos. Rnf8 y brca se localizan en nucleolo en ausencia de da\u00f1o en el adn y se trasladan a los foci tras la inducci\u00f3n de un da\u00f1o. Rpsa ancla a rnf8 en nucleolo mientras que brca requiere la presencia de rnf8 y de rpsa para localizarse en nucleolo. Rpsa se ubiquitina preferentemente por lys63 y su vida media no se ve alterada por los niveles de rnf8. Ensayos de ubiquitilaci\u00f3n m\u00e1s sensibles indican que rnf8 puede estar implicado en esta modificaci\u00f3n aunque quiz\u00e1 no directamente. La depleci\u00f3n de rpsa, rnf8, ubc13 o brca disminuye la s\u00edntesis proteica total, mientras que la sobreexpresi\u00f3n de rnf8 hace que los niveles de s\u00edntesis proteica en c\u00e9lulas irradiadas se equiparen a los de c\u00e9lulas sin tratar, sugiriendo que, al menos en parte, la disminuci\u00f3n de la s\u00edntesis proteica provocada por radiaci\u00f3n \u00c2\u00bf podr\u00eda estar mediada por la funci\u00f3n de rnf8.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudios funcionales de un nuevo inhibidor del enzima de conjugaci\u00f3n de ubiquitinas ubc13 y de la ubiq\u00c1\u00bcitina ligasa rnf8, con \u00e9nfasis en su papel en la respuesta al da\u00f1o al dna<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudios funcionales de un nuevo inhibidor del enzima de conjugaci\u00f3n de ubiquitinas ubc13 y de la ubiq\u00c1\u00bcitina ligasa rnf8, con \u00e9nfasis en su papel en la respuesta al da\u00f1o al dna <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Marta Guerra Rebollo <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 28\/09\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Timothy Thomson Okatsu<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: andr\u00e9s Aguilera l\u00f3pez <\/li>\n<li>bernat Crosas navarro (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Marta Guerra Rebollo El laboratorio de t. Thomson ha desarrollado de novo peque\u00f1os compuestos capaces de interferir [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"ast-content-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"footnotes":""},"categories":[951],"tags":[10985,221542,221541,13682],"class_list":["post-111123","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-barcelona","tag-andres-aguilera-lopez","tag-bernat-crosas-navarro","tag-marta-guerra-rebollo","tag-timothy-thomson-okatsu"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/111123","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=111123"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/111123\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=111123"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=111123"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=111123"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}