{"id":111319,"date":"2011-07-10T00:00:00","date_gmt":"2011-07-10T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/identificacion-y-caracterizacion-de-los-genes-espumantes-fpg1-de-saccharomyces-cerevisiae-y-cfgi-de-saccharomyces-pastorianus-carsbergensis\/"},"modified":"2011-07-10T00:00:00","modified_gmt":"2011-07-10T00:00:00","slug":"identificacion-y-caracterizacion-de-los-genes-espumantes-fpg1-de-saccharomyces-cerevisiae-y-cfgi-de-saccharomyces-pastorianus-carsbergensis","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/santiago-de-compostela\/identificacion-y-caracterizacion-de-los-genes-espumantes-fpg1-de-saccharomyces-cerevisiae-y-cfgi-de-saccharomyces-pastorianus-carsbergensis\/","title":{"rendered":"Identificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de los genes espumantes fpg1 de saccharomyces cerevisiae y cfgi de saccharomyces pastorianus (carsbergensis)."},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Luc\u00eda Blasco Otero <\/strong><\/h2>\n

Identificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de los genes espumantes fpg1 de saccharomyces cerevisiae y cfg1 de saccharomyces pastorianus (carlsbergensis). luc\u00eda blasco otero dep. Microbiolog\u00eda e parasitolog\u00eda las bebidas alcoh\u00f3licas son el producto biotecnol\u00f3gico de mayor producci\u00f3n dentro de las empresas biotecnol\u00f3gicas. La fermentaci\u00f3n alcoh\u00f3lica es probablemente el proceso biotecnol\u00f3gico m\u00e1s antiguo desarrollado por el hombre, existen evidencias arqueol\u00f3gicas de m\u00e1s de 7000 a\u00f1os (garc\u00eda garibay & l\u00f3pez-mung\u00eda canales, 2004). las bebidas alcoh\u00f3licas han sido mejoradas por el hombre buscando caracter\u00edsticas organol\u00e9pticas adecuadas al gusto de los consumidores. Tradicionalmente, la b\u00fasqueda de mejores caracter\u00edsticas organol\u00e9pticas en las bebidas alcoh\u00f3licas ha provocado la selecci\u00f3n indirecta de las levaduras responsables de la fermentaci\u00f3n. Actualmente el proceso de fermentaci\u00f3n es totalmente controlado y la tendencia actual es a la mejora gen\u00e9tica de las levaduras de manera directa mediante la aplicaci\u00f3n de t\u00e9cnicas del adn recombinante (pretorius, 2000). tanto en vinos espumosos como en la cerveza la espuma es una de las caracter\u00edsticas sensoriales m\u00e1s importantes ya que es percibida por el consumidor desde el momento en que se sirve y posteriormente cuando se bebe (evans & bamforth, 2009; mart\u00ednez- rodr\u00edguez & pueyo, 2009). las bebidas alcoh\u00f3licas son sistemas multicomponentes que adem\u00e1s de prote\u00ednas y alcohol contienen otras macromol\u00e9culas, muchas de ellas con actividad superficial por s\u00ed mismas o bien por interacci\u00f3n con otras. Por este motivo se han realizado estudios para determinar cu\u00e1les son los compuestos con mayor capacidad espumante en bebidas espumosas y se ha observado que en el caso de los vinos espumosos las macromol\u00e9culas con mayor capacidad espumog\u00e9nica son las glicoprote\u00ednas (sen\u00e9e et al, 1999; moreno-arribas et al, 2000; douglas et al, 2005). las glicoprote\u00ednas han sido identificadas como las macromol\u00e9culas dominantes en la espuma de los vinos espumosos, esto es debido a la naturaleza hidr\u00f3foba de las glicoprote\u00ednas, que favorece la uni\u00f3n de estas a las burbujas de gas, as\u00ed, los glucanos hidr\u00f3filos de estas se localizar\u00e1n en la capa acuosa entre la burbujas y la regi\u00f3n hidr\u00f3foba correspondiente a la regi\u00f3n proteica se situar\u00e1 hacia la cara interior de la burbuja, de manera que cuando la capa acuosa se hace m\u00e1s fina, \u00e9stas aumentan la viscosidad retardando el drenaje. De manera que los polip\u00e9ptidos hidr\u00f3fobos aumentan la tensi\u00f3n superficial de las burbujas aumentando la estabilidad de la espuma (sen\u00e9e et al, 1999; n\u00fa\u00f1ez et al., 2006). As\u00ed, es bien conocido que ciertas cepas de s. Cerevisiae son capaces de flotar hasta la superficie del mosto en fermentaci\u00f3n favoreciendo la formaci\u00f3n y estabilizaci\u00f3n de la espuma. Esta capacidad de producir espuma en estas cepas ha sido atribuida a la capacidad de las prote\u00ednas de la pared celular, y sobre todo de las manoprote\u00ednas, para adherirse a las burbujas de co2 (chiavari et al., 2000). en los vinos espumosos la mayor\u00eda de las manoprote\u00ednas son liberadas durante la segunda fermentaci\u00f3n y durante el proceso de envejecimiento que es cuando tiene lugar la autolisis de las levaduras (gon\u00ed\u00a7alves et al, 2002; feuillat, 2003; vuchot & bajard- sparrow, 2009). Durante la autolisis las glicoprote\u00ednas y los polisac\u00e1ridos de la pared celular de las levaduras son hidrolizados por las glucanasas que act\u00faan sobre enlaces de los glucanos de la pared celular liberando las manoprote\u00ednas que estaban enlazadas covalentemente a estos glucanos (charperntier & freyssinet, 1989; mart\u00ednez-rodr\u00edguez & pueyo; 2009). la presencia de prote\u00ednas de levadura en la cerveza se describi\u00f3 en diversos estudios en los que se caracterizaron las prote\u00ednas presentes en la cerveza. Mediante ensayos inmunol\u00f3gicos a partir de la espuma de la cerveza se detect\u00f3 por primera vez la presencia de ant\u00edgenos correspondientes a prote\u00ednas de levaduras, que ten\u00edan un tama\u00f1o entre 70000 y 120000 daltons y en otros estudios aparec\u00edan en las fracciones de 200000 daltons (hejgaard & s\u00ed\u00b8rensen, 1975; mohan et al., 1992). La implicaci\u00f3n de las levaduras en el mantenimiento de la espuma se estableci\u00f3 mediante ensayos en fermentaciones de mosto sint\u00e9tico donde se produc\u00eda la espuma artificialmente, estos estudios concluyeron que las levaduras no contribuyen tanto la producci\u00f3n como al mantenimiento y la estabilizaci\u00f3n de la espuma en la cerveza (kordialik-bogacka & campbell, 2000; kordialik-bogacka & ambroziak, 2004; douglas et al., 2006). genes de levaduras implicados en la producci\u00f3n de espuma kasahara et al. (1974) identific\u00f3 por primera vez los genes de un cepa de sake de s. cerevisiae responsables del car\u00e1cter espumante, a partir de ensayos de hibridaci\u00f3n entre cepas no espumantes y cepas espumantes, as\u00ed lleg\u00f3 a la conclusi\u00f3n de que este car\u00e1cter deb\u00eda estar determinado por al menos dos genes. Thornton (1978a,b), estudi\u00f3 el car\u00e1cter espumante en una cepa v\u00ednica de s. Cerevisiae, y mediante t\u00e9cnicas de hibridaci\u00f3n de t\u00e9tradas estableci\u00f3 que el car\u00e1cter espumante estaba determinado dos genes, fro1 y fro2, situados a una distancia el uno del otro de 21 centimorgans en el cromosoma vii. Concluy\u00f3 que eran dominantes y que eran genes no aditivos, de manera que aunque hubiese varias copias la cantidad de espuma obtenida era la misma. Adem\u00e1s estableci\u00f3 que estos genes eran al\u00e9licos de otros dos genes presentes en las cepas de sake (kasahara et al., 1974; tornton, 1978a, b). un nuevo gen implicado en la producci\u00f3n de espuma fue aislado a partir de la cepa de sake k7 de s. Cerevisiae. Este gen llamado awa1, codifica para la prote\u00edna awa1p que ha sido clasificada como una manoprote\u00edna con punto de anclaje al gpi que confiere hidrofobicidad a la superficie celular, de manera que favorece el mantenimiento de la espuma al adsorberse a la superficie de las burbujas. La implicaci\u00f3n de esta prote\u00edna en la espuma qued\u00f3 demostrada cuando al deleccionar el gen se observaba que el nivel de espuma que se produc\u00eda al fermentar era menor que cuando se utilizaba la cepa silvestre (shimoi et al., 2002). homotalismo y heterotalismo las levaduras se clasifican por su ciclo de vida como homot\u00e1licas o heterot\u00e1licas. Las c\u00e9lulas heterot\u00e1licas son de tipo conjugante estable, de manera que cuando se dividen por vegetativamente las c\u00e9lulas \u00c2\u00bf dan lugar a c\u00e9lulas \u00c2\u00bf, y las c\u00e9lulas a dan lugar a c\u00e9lulas a. Solamente conjugan dos c\u00e9lulas de tipo opuesto para formar un diploide que por meiosis dar\u00e1 lugar a c\u00e9lulas haploides de ambos tipos conjugantes. En el caso de las c\u00e9lulas homot\u00e1licas, las c\u00e9lulas diploides esporulan dando lugar a cuatro esporas haploides, \u00e9stas se dividen por mitosis y la c\u00e9lula madre cambia su tipo conjugante fusion\u00e1ndose con la hija y dando lugar de esta manera a un nuevo diploide a\/\u00c2\u00bf (herskowitz & jensen, 1991). el gen responsable del homotalismo es el gen ho que codifica para una endonucleasa espec\u00edfica que es necesaria para el cabio de tipo conjugante (herskowitz & jensen, 1991). objetivos – obtenci\u00f3n de cepas heterot\u00e1licas competentes para la conjugaci\u00f3n a partir de la cepa v\u00ednica 145a211 de saccharomyces cerevisiae y de la cepa cervecera weihenstephan 34\/70 de saccharomyces pastorianus. – identificaci\u00f3n y estudio de los genes responsables de la producci\u00f3n de espuma en las bebidas fermentadas, presentes en la cepa v\u00ednica 145a211 de saccharomyces cerevisiae y de la cepa cervecera weihenstephan 34\/70 de saccharomyces pastorianus. delecci\u00f3n de los genes ho de s. Cerevisiae y sc-ho de s. Pastorianus. la heterotalizaci\u00f3n de la cepa 145a211 de saccharomyces cerevisiae y de la cepa weihenstephan 34\/70 de saccharomyces pastorianus, se dise\u00f1\u00f3 un vector de interrupci\u00f3n del gen ho, al que se denomin\u00f3 pdho. Este vector contiene un casete de interrupci\u00f3n que consiste en un fragmento ho1, de 80 pb, que se corresponde con 16- 96 pb del gen ho de s. Cerevisiae y un fragmento ho2 de 137 pb, que se corresponde con 1572- 1654 pb del gen ho. El casete de interrupci\u00f3n ho-loxpkanmxloxp se utiliz\u00f3 para transformar las cepas homot\u00e1licas y diploide en el caso de 145a211 de s. cerevisiae y poliploide weihenstephan 34\/70 de s. Pastorianus. Los transformantes seleccionados resistentes a g418, eran diploides heterocigotos ho\/ho::kanmx, y por lo tanto solamente en un cromosoma del par estar\u00eda el gen ho interrumpido, estos transformantes esporularon, de manera que una vez separadas las cuatro esporas se seleccionaron las que eran resistentes a g418, y para comprobar que ya no eran homot\u00e1licas se cultivaron en medio de esporulaci\u00f3n comprobando as\u00ed su incapacidad para esporular. Posteriormente se estableci\u00f3 el tipo conjugante de las c\u00e9lulas seleccionadas, para ello se cruzaron con cepas gen\u00e9ticas de tipo conjugante conocido, csh84l (\u00c2\u00bf) y con la cepa csh89l (a). Como las cepas derivadas de la 145a211 y de w 34\/70 no presentan auxotrof\u00edas, la habilidad para conjugar se comprob\u00f3 por su capacidad para producir zigotos y esporas. Finalmente para eliminar el casete de interrupci\u00f3n las cepas obtenidas fueron transformadas con el pl\u00e1smido yep351-cre- cyh. al heterotalizar la cepa de s. Cerevisiae 145a211 se obtuvo una cepa haploide de s. cerevisiae, a la que se denomin\u00f3 sc22. La heterotalizaci\u00f3n de esta cepa se demostr\u00f3 al comprobar su habilidad para conjugar con otras cepas, ya que de otro modo hubiese conjugado con su hija dando lugar a un diploide homot\u00e1lico que siempre ser\u00eda capaz de esporular. Lo mismo ocurri\u00f3 con la cepa w 34\/70 de s. Pastorianus, aunque en este caso solo se interrumpi\u00f3 el gen sc-ho, la cepa fue heterotalizada para dar lugar a una nueva cepa denominada sp1, lo que corrobora que con la eliminaci\u00f3n de una de las copias es posible heterotalizar estas cepas, como refer\u00edan en estudio previos en los que se interrumpi\u00f3 el gen lg-ho. El nivel de ploid\u00eda de la cepa sp1 se redujo a la mitad y se hizo competente para conjugar con otras cepas. tanto la reducci\u00f3n en el nivel de ploid\u00eda como la habilidad para conjugar hacen a estas cepas susceptibles de ser mejoradas bien por t\u00e9cnicas de adn recombinante como por t\u00e9cnicas de selecci\u00f3n cl\u00e1sicas. estudio y an\u00e1lisis del gen responsable del car\u00e1cter espumante en la cepa v\u00ednica 145a211 de saccharomyces cerevisiae a partir de ensayos de microvinificaci\u00f3n con 36 cepas v\u00ednicas silvestres espumantes de s. Cerevisiae, se seleccion\u00f3 la cepa 145a211 por ser la que produc\u00eda la mayor cantidad de espuma y adem\u00e1s la espuma m\u00e1s estable. a partir del adn gen\u00f3mico de la cepa v\u00ednica 145a211, mediante pcr empleando los primers dise\u00f1ados a partir de la secuencia del gen espumante awa1 presente en la cepa fermentadora de sake k7, se amplific\u00f3 y secuenci\u00f3 un nuevo gen de 2313 pb, que se denomin\u00f3 fpg1 (foam promoting gene) y cuya secuencia fue depositada en la base de datos genbank con el c\u00f3digo eu414028.1. a partir de la secuencia g\u00e9nica se obtuvo la secuencia de una una prote\u00edna de 770 aa y 72512.22 da, y que presenta las caracter\u00edsticas t\u00edpicas de un precursor de manoprote\u00ednas. A partir del an\u00e1lisis de la secuencia proteica se observ\u00f3 que presentaba motivos t\u00edpicos de las glicoprote\u00ednas presentes en la pared celular de las levaduras. Las regiones n-terminal y c-terminal son hidr\u00f3fobas, contiene una p\u00e9ptido se\u00f1al (residuos 1 al 24) y un posible punto de anclaje al glicerolfosfatoinositol (gpi) (residuo 749), tambi\u00e9n poseen una regi\u00f3n rica en ser (residuos 29 al 480) que supone el 35,5% de los aa, una regi\u00f3n rica en thr (residuos 470 al 716) que es el 18,2% de los aa, numerosos puntos de o-glicosilaci\u00f3n, y dos puntos de n-glicosilaci\u00f3n (residuo 28 y residuo 35). una vez que este precursor de manoprote\u00ednas sufre las modificaciones postraduccionales, da lugar a la prote\u00edna fpg1p, que tiene un tama\u00f1o de 726 aa y un peso de 67812.68. los an\u00e1lisis de homolog\u00eda mostraron una elevada similitud con distintos genes y prote\u00ednas de la pared celular, que se correspond\u00edan con manoprote\u00ednas, y sobre todo con los genes hpf1 y awa1, ambos codificantes para manoprote\u00ednas y productor de espuma en el segundo caso. el gen se localiz\u00f3 cromos\u00f3micamente mediante la t\u00e9cnica del southern blot y t\u00e9cnicas de mapeo mit\u00f3tico por p\u00e9rdida de cromosomas y mapeo mei\u00f3tico para realizar el southern blot se hizo un pfge (pulse field gel electrophoresis) de los cromosomas de la cepa 145a211, y la sonda empleada para marcarlos se obtuvo a partir de un fragmento de 1000 pb del gen fpg1. la cepa 145a211 es prototr\u00f3fica, por ello para realizar el mapeo mei\u00f3tico y el mit\u00f3tico, fue necesario marcar el gen fpg1 de la cepa heterot\u00e1lica sc22, para ello el gen se interrumpi\u00f3 con el casete de interrupci\u00f3n loxp-kanmx-loxp del vector pug6, dando lugar a la cepa sch2 \u00c2\u00bfho fpg1::kanmx, finalmente la cepa sch2 se cruz\u00f3 con otras cepas de s. Cerevisiae con marcadores cromos\u00f3micos conocidos. As\u00ed, se pudo establecer que el gen fpg1 est\u00e1 ubicado en el cromosoma vii en la posici\u00f3n -119 cm del brazo izquierdo. estudios fenot\u00edpicos de la prote\u00edna fpg1p en primer lugar para poder realizar los estudios fenot\u00edpicos se obtuvo una cepa con el gen fpg1 deleccionado, a la que se denomin\u00f3 dha2-16. Para obtener esta cepa la cepa silvestre 145a211 se transform\u00f3 con el casete de interrupci\u00f3n loxp-kanmx-loxp del vector pug6, y una vez obtenidos los transformantes con las dos copias del gen interrumpidas se transformaron con el vector yep351-cre-cyh, con el que se elimin\u00f3 el casete de interrupci\u00f3n obteni\u00e9ndose as\u00ed la cepa dha2-16 \u00c2\u00bffpg1. para determinar si la prote\u00edna fpg1p est\u00e1 en la pared celular se hizo un ensayo de sensibilidad a la liticasa de las cepas 145a211 y dha2-16. En los cultivos que crecieron durante 48h, la pared celular es m\u00e1s gruesa y contiene m\u00e1s \u00edY-glucano por lo que se observ\u00f3 que la sensibilidad de la cepa 145a211 era casi la mitad que a las 12h y en el caso de la cepa dha2-16 apenas es sensible a la liticasa. La diferencia en la sensibilidad entre ambas cepas, indicaba que la prote\u00edna est\u00e1 ubicada en la pared celular, ya que la liticasa contiene \u00edY-glucanasas que rompen los enlaces de \u00edY-glucano de la pared celular. Las c\u00e9lulas de ambas cepas te\u00f1idas con calcofluor white, se observaron con un transiluminador observ\u00e1ndose m\u00e1s brillo en el pocillo correspondiente a la cepa con el gen fpg1 deleccionado que en la cepa silvestre 145a211. Este resultado implica que en la cepa dha2-16 la prote\u00edna fpg1p ha sido sustituida por quitina. otros ensayos fenot\u00edpicos mostraron los mismos resultados. los ensayos de hidrofobicidad de la superficie se observ\u00f3 que la hidrofobicidad era mayor en la cepa 145a211 que en la cepa dha2-16, lo que indica que la prote\u00edna confiere hidrofobicidad a las c\u00e9lulas y que por lo tanto debe estar relacionada con la estabilizaci\u00f3n de la espuma. extracci\u00f3n de la prote\u00edna fpg1 las cepas 145a211 y dha2-16 fueron cultivadas en presencia de tunicamicina, que inhibe la n-glicosilaci\u00f3n de las proet\u00ednas. La prote\u00edna se extrajo mediante el tratamiento con liticasa de las paredes celulares. Una vez extra\u00eddo el extracto proteico de ambas cepas se someti\u00f3 a una electroforesis en geles de sds-poliacrilamida, obteni\u00e9ndose una banda cercana a los 70 kda en el carril correspondiente a la cepa 145a211 que no aparec\u00eda en el carril correspondiente a la cepa dha2-16. Esta banda tiene el tama\u00f1o de la prote\u00edna fpg1p tras haber sufrido las modificaciones postraduccionales. implicaci\u00f3n de fpg1p en el fenotipo espumante para establecer la implicaci\u00f3n del la prote\u00edna fpg1p en la producci\u00f3n de espuma se realizaron ensayos de microfermentaci\u00f3n empleando como cultivo iniciador la cepa espumante 145a211 y la cepa dha2-16. Se observ\u00f3 que tras 24h de fermentaci\u00f3n la cantidad de espuma era mayor en los tubos correspondientes a las fermentaciones con la cepa 145a211 que en los tubos fermentados con la cepa dha2-16. Aunque tras 48h la cepa dha2-16 hab\u00eda producido algo m\u00e1s de espuma esta no se hab\u00eda mantenido, mientras que en la cepa 145a211 la espuma si se manten\u00eda. As\u00ed se confirma que la prote\u00edna fpg1p est\u00e1 implicada en la producci\u00f3n de espuma y en el mantenimiento de la estabilidad de la misma. con la finalidad de establecer claramente la implicaci\u00f3n de la prote\u00edna fpg1p en la producci\u00f3n de espuma, el gen fpg1 se insert\u00f3 en el vector de expresi\u00f3n de s. Cerevisiae pyes2 (invitrogen), y este vector con el gen fpg1 se clon\u00f3 en la cepa de s. Cerevisiae no espumante mi2b. La expresi\u00f3n del gen se indujo durante 48h en presencia de galactosa, una vez pasado este tiempo, las c\u00e9lulas se recuperaron y se emplearon para realizar ensayos de fermentaci\u00f3n. Las fermentaciones se mantuvieron durante dos d\u00edas, y se observ\u00f3 una clara diferencia en la producci\u00f3n de espuma entre los tubos fermentados con cepa control mi2b y los tubos fermentados con la cepa mi2b pyes2- fpg1, siendo mayor la cantidad en el segundo caso. Esto demuestra claramente que la prote\u00edna fg1p es responsable de la producci\u00f3n de espuma en los vinos. finalmente se realiz\u00f3 un ensayo de recuperaci\u00f3n del fenotipo espumante que confirm\u00f3 los resultados previos. estudio y an\u00e1lisis del gen responsable del car\u00e1cter espumante en la cepa cervecera weihenstephan 34\/70 de saccharomyces pastorianus a partir del adn gen\u00f3mico de la cepa cervecera weihensephan 34\/70 de saccharomyces pastorianus, mediante pcr empleando los primers dise\u00f1ados a partir de la secuencia del gen espumante awa1 presente en la cepa fermentadora de sake k7, se amplific\u00f3 y secuenci\u00f3 un nuevo gen de 3408 pb, que se denomin\u00f3 cfg1 (carlsbergensis foaming gene) que fue depositado en la base de datos genbank con el c\u00f3digo eu414029.1. este gen codifica para la prote\u00edna cfg1p de 1136 aa y un peso molecular de 110985.69 da, que presenta las caracter\u00edsticas t\u00edpicas de los precursores de manoprote\u00ednas, es decir, un p\u00e9ptido se\u00f1al, un punto de anclaje al gpi, una regi\u00f3n rica en serina, una regi\u00f3n rica en treonina, est\u00e1 muy o-glicosilado y presenta cinco puntos de n-glicosilaci\u00f3n. los an\u00e1lisis de homolog\u00eda determinaron que era altamente hom\u00f3logo al gen espumante awa1 de la cepa de sake k7, adem\u00e1s de presentar homolog\u00eda con otros genes codificantes de manoprote\u00ednas entre los que se incluyen hpf1 y el otro gen de s. cerevisiae descrito en este trabajo, fpg1. al ser s. Pastorianus un organsimo poliploide no se pudo realizar el mapeo mei\u00f3tico pero si el mapeo mit\u00f3tico mediante southern blot y p\u00e9rdida cromos\u00f3mica (wood, 1982) estableciendo su ubicaci\u00f3n en el cromosoma xv, al igual que el gen espumante awa1. el southern blot se llev\u00f3 a cabo hibridando una sonda que se correspond\u00eda con el gen cfg1 sobre los cromosomas de la cepa w 34\/70 separados mediante pfge. El mapeo mei\u00f3tico se realiz\u00f3 mediante cruces entre la cepa heterotalizada sph5, con el gen cfg1 interrumpido con el casete loxp-kanmx-loxp, y cepas gen\u00e9ticas de s. Cerevisiae que presentaban marcadores conocidos. estudios fenot\u00edpicos de la prote\u00edna cfg1p en primer lugar se obtuvo una cepa con la delecci\u00f3n del gen cfg1, a la que se denomin\u00f3 spha1b. Para ello la cepa w34\/70 de s. Pastorianus fue transformada con el casete de interrupci\u00f3n loxp-kanmx-loxp del vector pug6. Los transformantes obtenidos conten\u00edan dos copias del gen interrumpidas, estos, se transformaron con el vector yep351-cre-cyh, con el que se elimin\u00f3 el casete de interrupci\u00f3n obteni\u00e9ndose as\u00ed la cepa spha1b \u00c2\u00bfcfg1. para establecer la ubicaci\u00f3n de la prote\u00edna se realizaron ensayos de sensibilidad a la liticasa. Ser observ\u00f3 que la cepa silvestre era m\u00e1s sensible a la liticasa a las 12h que a las 48h debido al engrosamiento que sufre la pared durante el crecimiento. La cepa spha1b sin embargo, a las 12 h era m\u00e1s sensible que la cepa silvestre a la liticasa, sin embargo a las 48h apenas hay descenso en la densidad \u00f3ptica, lo que sugiere que el espacio dejado por esta prote\u00edna est\u00e1 siendo ocupado por otro compuesto como la quitina que no es sensible a la liticasa. los ensayos de hidrofobicidad de la superficie se observ\u00f3 que la hidrofobicidad era mayor en la cepa w 34\/70 que en la cepa spha1b, lo que indica que la prote\u00edna confiere hidrofobicidad a las c\u00e9lulas y que por lo tanto debe estar relacionada con la estabilizaci\u00f3n de la espuma. extracci\u00f3n de la prote\u00edna cfg1p las cepas w 34\/70 y la cepa spha1b se cultivaron en presencia de tunicamicina para evitar la n-glicosilaci\u00f3n de la prote\u00edna. Una vez alcanzada la densidad \u00f3ptica adecuada se realiz\u00f3 la extracci\u00f3n de las prote\u00ednas de la pared celular por el m\u00e9todo post-alcali. el extracto proteico obtenido se someti\u00f3 a una electroforesis de prote\u00ednas en geles de sds-poliacrilamida, observ\u00e1ndose en la calle correspondiente al extracto proteico de la cepa silvestre w34\/70 un banda de aproximadamente 105kda, que es el tama\u00f1o aproximado de la prote\u00edna cfg1p tras las modificaciones postraduccionales. En la calle correspondiente a la cepa sin la prote\u00edna cfg1p, spha1b, no se observ\u00f3 ninguna banda de este tama\u00f1o. Estos resultados sugieren nuevamente que la prote\u00edna cfg1p est\u00e1 situada en la pared celular. estudio de la capacidad de producci\u00f3n de espuma de la prote\u00edna cfg1p las cepas w34\/70 y spha1b se emplearon como inoculo de mosto cervecero para llevar a cabo estudios de la producci\u00f3n de espuma de estas cepas. Tras un d\u00eda de fermentaci\u00f3n ambas cepas produc\u00edan la misma cantidad de espuma, sin embargo, tras dos d\u00edas en el mosto fermentado con la cepa spha1b la espuma se hab\u00eda colapsado, mientras que en el mosto fermentado con la cepa silvestre se manten\u00eda el mismo nivel de espuma. Este ensayo se realiz\u00f3 tambi\u00e9n en mosto de uva con los mismos resultados. una vez finalizada la fermentaci\u00f3n la estabilidad de la espuma en la cerveza analiz\u00f3 mediante el m\u00e9todo de agitaci\u00f3n y midiendo el nivel de espuma producido cada cinco minutos. Se observ\u00f3 que la espuma en la cerveza producida con la cepa spha1b se colapsaba m\u00e1s r\u00e1pidamente que en la producida con la cepa silvestre. estos resultados sugieren que el papel principal de la prote\u00edna cfg1p en la producci\u00f3n de espuma en la cerveza es la estabilizaci\u00f3n de la misma. finalmente se realizaron ensayos de sobreexpresi\u00f3n de la prote\u00edna. Para ello el fpg1 se clon\u00f3 en el vector de expresi\u00f3n pyes2 (invitrogen) y se transform\u00f3 en la cepa de laboratorio de s. Cerevisiae mi2b. La expresi\u00f3n del gen se indujo durante 48h en presencia de galactosa, una vez pasado este tiempo, las c\u00e9lulas se recuperaron y se emplearon para realizar ensayos de fermentaci\u00f3n. Las fermentaciones se mantuvieron durante dos d\u00edas, y se observ\u00f3 una clara diferencia en la producci\u00f3n de espuma entre los tubos fermentados con cepa control mi2b y los tubos fermentados con la cepa mi2b pyes2-cfg1, siendo mayor la cantidad en el segundo caso. Esto demuestra claramente que la prote\u00edna cfg1p est\u00e1 implicada en el proceso de producci\u00f3n de espuma durante la fermentaci\u00f3n de los mostos. conclusiones – se han heterotalizado la cepa v\u00ednica 145a211 de s. Cerevisiae y la cepa cervecera weihenstephan 34\/70 de s. Pastorianus. – se ha conseguido cepas competentes para la conjugaci\u00f3n a partir de la cepa v\u00ednica 145a211 de s. Cerevisiae y de la cepa cervecera weihenstephan 34\/70 de s. Pastorianus. – el gen fpg1 (foam promoting gene) de la cepa v\u00ednica 145a211 de s. Cerevisiae es un gen de 2313 pb que se encuentra localizado en el cromosoma vii de dicha cepa. – el gen fpg1 de la cepa v\u00ednica 145a211 de s. Cerevisiae, codifica para una prote\u00edna de 771 aa y 72512.22 da, denominada fpg1p. – en la cepa weihenstephan 34\/70 se ha identificado un gen, cfg1 (carlsbergensis foaming gene), de 3408 pb que se encuentra ubicado en el cromosoma sc xv de dicha cepa. – el gen cfg1 codifica para una prote\u00edna, cfg1p, de 1136 aa y 110976,75 da. – tanto la prote\u00edna fpg1p como la prote\u00edna cfg1p son manoprote\u00ednas presentes en la pared celular de las levaduras. – ni la prote\u00edna fpg1p de la cepa v\u00ednica 145a211 de s. Cerevisiae ni la prote\u00edna cfg1p de la cepa cervecera weihenstephan 34\/70, intervienen en el metabolismo fermentativo de la c\u00e9lula. – el gen fgp1 de la cepa v\u00ednica 145a211 de s. Cerevisiae y el gen cfg1 de la cepa cervecera weihenstephan 34\/70 de s. Pastorianus son responsables del car\u00e1cter espumante en cada caso. – tanto la prote\u00edna fpg1p como la prote\u00edna cfg1p confieren estabilidad a la espuma. referencias – charperntier c & freyssinet m (1989) the mechanism of yeast autolysis in wine. Yeast, 5, 181-186. – chiavari c, zambonelli c, benevelli m, caggia c & tini v (2000) structure of foam and film forming cells of saccharomyces cerevisiae. Annals of microbiology, 50, 167-176. – douglas p, meneses fj & jiranek v (2006) filtration, haze and foam characteristics of fermented wort mediated by yeast strain. Journal of applied microbiology 100: 58-64. – evans e & bamforth cw (2009) beer foam, achieving a suitable head. Beer: a quality perspective. Pp.7-66. 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Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abIdentificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de los genes espumantes fpg1 de saccharomyces cerevisiae y cfgi de saccharomyces pastorianus (carsbergensis).<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
    \n
  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Identificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de los genes espumantes fpg1 de saccharomyces cerevisiae y cfgi de saccharomyces pastorianus (carsbergensis). <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Luc\u00eda Blasco Otero <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 07\/10\/2011<\/li>\n<\/ul>\n

     <\/p>\n

    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
      \n
    • Director de la tesis<\/strong>\n
        \n
      • Patricia Veiga Crespo<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
          \n
        • Presidente del tribunal: germ\u00e1n Larriba calle <\/li>\n
        • Miguel Vi\u00f1as ciordia (vocal)<\/li>\n
        • Jos\u00e9 Antonio Gil santos (vocal)<\/li>\n
        • Jos\u00e9 pedro Martinez garcia (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

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