{"id":111464,"date":"2018-03-11T10:38:01","date_gmt":"2018-03-11T10:38:01","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/efecto-de-la-administracion-de-ppi-2458-sobre-los-procesos-de-proliferacion-celular-y-apoptosis-en-un-modelo-in-vitro-de-hepatocarcinoma\/"},"modified":"2018-03-11T10:38:01","modified_gmt":"2018-03-11T10:38:01","slug":"efecto-de-la-administracion-de-ppi-2458-sobre-los-procesos-de-proliferacion-celular-y-apoptosis-en-un-modelo-in-vitro-de-hepatocarcinoma","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/mecanismos-de-accion-de-los-farmacos\/efecto-de-la-administracion-de-ppi-2458-sobre-los-procesos-de-proliferacion-celular-y-apoptosis-en-un-modelo-in-vitro-de-hepatocarcinoma\/","title":{"rendered":"Efecto de la administraci\u00f3n de ppi-2458 sobre los procesos de proliferaci\u00f3n celular y apoptosis en un modelo in vitro de  hepatocarcinoma"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Javier Martin Renedo <\/strong><\/h2>\n<p>Introducci\u00f3n el carcinoma hepatocelular (hcc) es el quinto tipo de tumor m\u00e1s frecuente, y el tercero por causa de mortalidad en el mundo. Los f\u00e1rmacos utilizados en el tratamiento del hcc normalmente son citot\u00f3xicos y ninguno de ellos es espec\u00edfico para el tratamiento de la enfermedad, presentando una gran cantidad de efectos secundarios. Recientemente, ha existido un gran inter\u00e9s en la utilizaci\u00f3n de los antiangiog\u00e9nicos en el tratamiento del c\u00e1ncer. Uno de estos f\u00e1rmacos, la fumagilina, procedente de aspergillus fumigatus fresenius, presenta una potente actividad citost\u00e1tica in vitro. Desafortunadamente, su administraci\u00f3n tiene una gran cantidad de efectos secundarios, habi\u00e9ndose intensificado los esfuerzos por sintetizar derivados con mayor actividad y menores efectos no deseados. Uno de estos derivados, el ppi-2458, an\u00e1logo activo de la fumagilina, presenta una potente actividad antiangiog\u00e9nica y menores efectos secundarios. Aunque los estudios son escasos, este nuevo f\u00e1rmaco ha mostrado efectos beneficiosos en diferentes patolog\u00edas como melanoma y linfoma no hodking. Debido a que no existen datos de los efectos del ppi-2458 en el hcc, en este estudio hemos investigado el efecto antiproliferativo, oncost\u00e1tico y proapopt\u00f3tico en un modelo in vitro de hcc.   materiales y m\u00e9todos                  para la realizaci\u00f3n de este estudio se ha utilizado la l\u00ednea celular derivada de hcc humano denominada hepg2. Los an\u00e1lisis fueron realizados a tiempos de 0, 2, 4 y 6 d\u00edas de tratamiento con ppi-2458 a una concentraci\u00f3n de 10 nm. Los m\u00e9todos anal\u00edticos empleados fueron la determinaci\u00f3n de la viabilidad celular, an\u00e1lisis del ciclo celular, determinaci\u00f3n de apoptosis mediante la actividad de caspasas 3, 8 y 9. Junto con estos an\u00e1lisis se midieron por la t\u00e9cnica de western blot, niveles de prote\u00ednas relacionadas con ciclo celular (cdk2, 4 y 6, ciclinas d y e, pcna, p21, p53 y rb), con la apoptosis (bcl-2, bad y bax) y con proliferaci\u00f3n (erk, akt, jnk p38 y stat3) adem\u00e1s, se determin\u00f3 utilizando la t\u00e9cnica de pcr a tiempo real, la producci\u00f3n de citocinas y factores de crecimiento (tnf\u00c2\u00bf, il-1\u00edY y vegf).  resultados la administraci\u00f3n de ppi-2458 redujo la viabilidad de las c\u00e9lulas de forma tiempo-dependiente a la concentraci\u00f3n de 10 nm, m\u00ednima concentraci\u00f3n utilizada que consigui\u00f3 reducir la viabilidad en mayor proporci\u00f3n. Tras analizar la viabilidad, decidimos medir los posibles cambios en la cin\u00e9tica del ciclo celular, revel\u00e1ndose un incremento significativo del n\u00famero de c\u00e9lulas en la fase g0\/g1. An\u00e1lisis complementarios de marcadores de ciclo celular, mostraron en fase g1 temprana, un aumento de la ciclina d1, sin variaciones en la cdk4 y 6. En fase g1 tard\u00eda se observ\u00f3 una disminuci\u00f3n de ciclina e, sin cambios en la cdk2, acompa\u00f1ado por un aumento de p21 y una disminuci\u00f3n de pcna.  en cuanto al estudio de p53, fosfo p53, rb y fosfo rb, se observ\u00f3 un incremento de fosfo p53 sin variaciones en su forma no fosforilada, y una disminuci\u00f3n en fosfo rb con un aumento paralelo de rb total.  al determinar la actividad de las caspasas 3 8 y 9, se mostr\u00f3 un incremento de tales actividades tras seis d\u00edas de tratamiento con el f\u00e1rmaco objeto de estudio. El an\u00e1lisis de prote\u00ednas relacionadas con la apoptosis revel\u00f3 una disminuci\u00f3n en bcl-2, sin variaciones en bax y bad. Al medir v\u00edas se\u00f1alizaci\u00f3n relacionadas con la apoptosis y la proliferaci\u00f3n se observ\u00f3 una bajada de fosfo erk y fosfo akt, sin alteraciones en fosfo p38 y fosfo jnk. Los niveles totales de estas prote\u00ednas no mostraron ning\u00fan cambio. En cuanto a stat3 se determin\u00f3 la existencia de un incremento de la forma activada de este factor de transcripci\u00f3n.  al utilizar un inhibidor de stat3, stattic, durante 4 d\u00edas se vislumbr\u00f3 que tanto fosfo stat3 como la ciclina d1 y p21, disminu\u00edan por la administraci\u00f3n del mismo en combinaci\u00f3n con ppi-2458 o solamente con el inhibidor.  el estudio del efecto del ppi-2458 sobre la s\u00edntesis de rna mensajero de citocinas inflamatorias y factores de crecimiento, revel\u00f3 que la administraci\u00f3n de ppi-2458 induc\u00eda un aumento de las tres mol\u00e9culas estudiadas, tnf\u00c2\u00bf, il-1\u00edY y vegf. La inhibici\u00f3n de stat3, en combinaci\u00f3n con el f\u00e1rmaco objeto de estudio, no produjo cambios en la s\u00edntesis de tnf\u00c2\u00bf, increment\u00f3 la producci\u00f3n de il-1\u00edY y disminuy\u00f3 los niveles de vegf.   discusi\u00f3n el estudio demuestra que el ppi-2458 inhibe la proliferaci\u00f3n, la progresi\u00f3n del ciclo celular e induce apoptosis cuando este f\u00e1rmaco se administra a las c\u00e9lulas durante 2, 4 y 6 d\u00edas a la concentraci\u00f3n de 10 nm. Los efectos antiproliferativos del ppi-2458 se ha demostrado previamente en c\u00e9lulas de melanoma y de linfoma no hodking. Al analizar el ciclo celular, se observ\u00f3 una parada del mismo en la fase g0\/g1. Estudios previos han mostrado efectos similares de la fumagilina sobre el ciclo celular en la misma fase, adem\u00e1s nuestro grupo de investigaci\u00f3n ha publicado previamente que el tnp-470, otro derivado de la fumagilina, deten\u00eda el ciclo en dicha fase en un modelo in vivo de hcc. En c\u00e9lulas eucariotas la fase g1 temprana se controla por la ciclina d y las cdks 4 y 6, mientras que en la fase g1 tard\u00eda, dicho control se lleva a cabo por la ciclina e y cdk2. Nuestro estudio ha demostrado que la administraci\u00f3n de ppi-2458 increment\u00f3 la expresi\u00f3n de ciclina d1 y disminuy\u00f3 la ciclina e, sin cambios en las cdk4, 6 y 2. Resultados similares se han observado tras la administraci\u00f3n de tnp-470 en c\u00e9lulas huvec, estando asociado el aumento de ciclina d1 con una mayor sensibilidad de las c\u00e9lulas huvec al tnp-470. En cuanto a pcna, factor de procesividad de la adn polimerasa, se trata de un prote\u00edna que se asocia f\u00edsicamente a p21. La uni\u00f3n de pcna y p21 impide la acci\u00f3n ciclost\u00e1tica de \u00e9sta \u00faltima prote\u00edna en la fase g1. En nuestro estudio ppi-2458 fue capaz de reducir la expresi\u00f3n de pcna, resultado en concordancia con la disminuci\u00f3n de esta prote\u00edna en resultados alcanzados por otros autores cuando el f\u00e1rmaco fue utilizado en un modelo de artritis reumatoide. Como ya se ha indicado previamente por otros autores, la parada del ciclo en fase g1 est\u00e1 relacionada con p53 y p21. Nuestros resultados est\u00e1n de acuerdo con tales observaciones, ya que la administraci\u00f3n de ppi-2458 produjo un incremento de la forma fosforilada de p53 y de p21, adem\u00e1s de se ha demostrado el incremento del p21 debido a este f\u00e1rmaco en c\u00e9lulas de melanoma. la fosforilaci\u00f3n de rb que permite la liberaci\u00f3n de e2f precipitando en fase s, puede ser debida al complejo ciclina e-cdk2. La administraci\u00f3n de ppi-2458 disminuy\u00f3 los niveles de fosfo rb, pudiendo asociar estos cambios a la diminuci\u00f3n de los niveles de ciclina e y al incremento de p21, que inhibe el complejo cilcina e-cdk2. El factor de transcripci\u00f3n stat3 actua, generalmente, como promotor de la supervivencia y de la proliferaci\u00f3n celular, pero tambi\u00e9n es capaz de regular la s\u00edntesis de cilcina d1 y de p21. Estos resutados est\u00e1n en condordancia con los nuestros, que muestran la disminuci\u00f3n de la ciclina d1 y de p21 cuando se administr\u00f3 stattic (inhibidor de stat3) y ppi-2458 a las c\u00e9lulas hepg2. las v\u00edas de se\u00f1alizaci\u00f3n akt y erk est\u00e1n asociadas a la proliferaci\u00f3n y supervivencia. Tambi\u00e9n se ha visto que pueden inducir la producci\u00f3n de bcl-2, prote\u00edna antiapopt\u00f3tica que puede evitar la muerte celular. Por el contrario, jnk y p38 pueden inducir miembros proapopt\u00f3ticos de la familia de prote\u00ednas bcl-2: bax y bad. En nuestros experimentos hemos detectado una disminuci\u00f3n de fosfo-akt y fosfo-erk tras seis d\u00edas de tratamiento, sin variaciones en los niveles de jnk y p38 tanto totales como fosforilados. Estos resultados est\u00e1n de acuerdo con los obtenidos por otros autores que muestran que, tras la administraci\u00f3n de tnp-470, se produce una disminuci\u00f3n de fosfo-akt  y de fosfo-erk, sin cambios en p38 (wang et al., 2006). En nuestros experimentos la incubaci\u00f3n de las c\u00e9lulas con ppi-2458 increment\u00f3 la actividad de las caspasas 3, 8 y 9 y disminuy\u00f3 los niveles de la prote\u00edna bcl-2, sin cambios en bax y bad. Aunque no existen datos sobre los efectos proapopt\u00f3ticos del ppi-2458, la disminuci\u00f3n en bcl-2 sin cambios en bax y bad se ha observado en hcc cuando se administran otro tipo de f\u00e1rmacos, y la administraci\u00f3n de tnp-470 en c\u00e1ncer de mama, es capaz de disminuir los niveles de bcl-2 y de inducir apoptosis en diferentes tipos tumorales. la investigaci\u00f3n sobre el ppi-2458 est\u00e1 vinculada al estudio de la liberaci\u00f3n de citocinas. Estudios previos no determinaron variaci\u00f3n alguna en estas mol\u00e9culas tras la administraci\u00f3n del f\u00e1rmaco objeto de estudio, aunque tales investigaciones realiza incubaciones con el f\u00e1rmaco a tiempos m\u00e1s cortos. De tal manera, la administraci\u00f3n de ppi-2458 revel\u00f3 un incremento en la producci\u00f3n de arn mensajero de tnf\u00c2\u00bf, il-1\u00edY y vegf.  la activaci\u00f3n de stat3 puede ser debida a la il-1\u00edY, que puede inducir la parada del ciclo celular, pudiendo sugerir una relaci\u00f3n con la detenci\u00f3n del ciclo provocada por el ppi-2458. Adem\u00e1s, podemos especular sobre la relaci\u00f3n entre el tnf\u00c2\u00bf y la il-1\u00edY, ya que se ha publicado que esta \u00faltima puede inducir la s\u00edntesis de tnf\u00c2\u00bf. La utilizaci\u00f3n de stattic, impide la activaci\u00f3n de stat3, necesaria para que act\u00fae como factor de transcripci\u00f3n. El empleo de este inhibidor en nuestro estudio, revel\u00f3 que el bloqueo de stat3 no disminu\u00eda la s\u00edntesis de arn mensajero de tnf\u00c2\u00bf, increment\u00e1ndose adem\u00e1s la producci\u00f3n de arn de il-1\u00edY. El bloqueo de stat3 en distintos modelos de estudio, ha revelado que puede disminuir la s\u00edntesis de il-1\u00edY sin cambios en tnf\u00c2\u00bf, pueden incrementar ambas citocinas, o incluso disminuirlas . Nuestros hallazgos y los de otros autores parecen indicar la existencia de otros factores implicados en el control de la liberaci\u00f3n y producci\u00f3n de citocinas. en cuanto al vegf, principal factor proangiog\u00e9nico, tiene una relaci\u00f3n directa con stat3, ya que la inhibici\u00f3n de este factor de transcripci\u00f3n es capaz de bloquear la s\u00edntesis de vegf, adem\u00e1s de reducir el crecimiento tumoral y la met\u00e1stasis. Estas observaciones est\u00e1n en concordancia con nuestros resultados, donde el ppi-2458 increment\u00f3 la forma activa de stat3, aumentando en paralelo los niveles de arnm de vegf, mientras que la inhibici\u00f3n de stat3 disminuy\u00f3 la producci\u00f3n de vegf.  el estudio realizado indica que el ppi-2458 es capaz de reducir la viabilidad, detener el ciclo celular e inducir apoptosis en las c\u00e9lulas hepg2 derivadas de hepatocarcinoma. La disminuci\u00f3n en la tasa de crecimiento puede estar mediada por la prote\u00edna stat3, debido a su papel en la sobreexpresi\u00f3n de la ciclina d1 y de p21. A la luz de estos hallazgos, podemos afirmar que el ppi-2458 puede, potencialmente, ser utilizado en la terapia farmacol\u00f3gica para el tratamiento del hcc. Sin embargo se necesitan estudios ulteriores que puedan elucidar los mecanismos por los cuales este f\u00e1rmaco produce la inhibici\u00f3n del crecimiento de hcc.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Efecto de la administraci\u00f3n de ppi-2458 sobre los procesos de proliferaci\u00f3n celular y apoptosis en un modelo in vitro de  hepatocarcinoma<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Efecto de la administraci\u00f3n de ppi-2458 sobre los procesos de proliferaci\u00f3n celular y apoptosis en un modelo in vitro de  hepatocarcinoma <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Javier Martin Renedo <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Le\u00f3n<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 20\/10\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Jos\u00e9 Luis Mauriz Gutierrez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Jes\u00fas Culebras fern\u00e1ndez <\/li>\n<li>ulla Stenius (vocal)<\/li>\n<li>Mar\u00eda victoria Garc\u00eda mediavilla (vocal)<\/li>\n<li>Juan  Francisco Medina cabrera (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Javier Martin Renedo Introducci\u00f3n el carcinoma hepatocelular (hcc) es el quinto tipo de tumor m\u00e1s frecuente, y 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