{"id":111774,"date":"2018-03-11T10:38:27","date_gmt":"2018-03-11T10:38:27","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/in-vivo-and-in-vitro-studies-of-the-lrpc-topb-operon-of-bacillus-subtilis\/"},"modified":"2018-03-11T10:38:27","modified_gmt":"2018-03-11T10:38:27","slug":"in-vivo-and-in-vitro-studies-of-the-lrpc-topb-operon-of-bacillus-subtilis","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/biologia-molecular\/in-vivo-and-in-vitro-studies-of-the-lrpc-topb-operon-of-bacillus-subtilis\/","title":{"rendered":"In vivo and in vitro studies of the lrpc-topb operon of bacillus subtilis."},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Esther Patricia Garcia Tirado <\/strong><\/h2>\n<p>El gen lrpc de bacillus subtilis, que ha sido caracterizado como un gen no esencial, posiblemente  regula el metabolismo de amino\u00e1cidos celular y disminuye el tiempo de entrada en fase de  esporulaci\u00f3n (beloin et al., 1997). Lrpc es capaz de autoregular su propia expresi\u00f3n (beloin et al.,  2000). Lrpc es una prote\u00edna de uni\u00f3n a dna independiente de secuencia, presentando una mayor  afinidad por dna de doble cadena curvado, aunque es capaz de unirse a un amplio rango de tipos  de dna. Teniendo en cuenta estos datos bioqu\u00edmicos se ha propuesto un posible papel de lrpc  como prote\u00edna arquitectural, lo que viene avalado por los datos de microscop\u00eda de fuerzas at\u00f3micas que revelan la uni\u00f3n de lrpc al dna formando los denominados \u00c2\u00bfnucleosomas\u00c2\u00bf celulares (beloin  et al., 2003). La resoluci\u00f3n del cristal de lrpc revela un oct\u00e1mero en estructura cruciforme, que se  unir\u00eda al dna curv\u00e1ndolo y compact\u00e1ndolo (thaw et al., 2006). En b.Subtilis, el gen topb,  que se  encuentra aguas abajo del gen  lrpc, codifica para la prote\u00edna topoisomerasa iii. Esta prote\u00edna  pertenece a la superfamilia de las topoisomerasas tipo ia.  El    mecanismo  de  acci\u00f3n  de  las  topoisomerasas en general consiste en la ruptura de una o las dos hebras del dna mediante el  ataque nucleof\u00edlico de la tirosina del centro activo de la enzima al fosfato del esqueleto del dna.  la forma en la que se lleva a cabo dicha funci\u00f3n ha llevado a clasificar a las topoisomerasas en  dos familias denominadas tipo i (cortan una hebra del dna) y tipo ii (cortan las dos hebras del  dna). Nos centraremos en las topoisomerasas tipo ia, que comprenden topo i y iii de  procariotas y topo iii de eucariotas. Estas enzimas crean un enlace 5\u00c2\u00bf-fosfotirosil con el dna,  cortando una de las hebras del dna, lo que les permite relajar un dna inicialmente  superenrollado (depew et al., 1978; liu and wang, 1979; tse et al., 1980). Topo iii de e.Coli ha  sido caracterizada como una enzima capaz de decatenar intermediarios tard\u00edos de tipo  \u00c2\u00bf  del  pl\u00e1smido pbr322  (digate and marians, 1988). Sin embargo, a diferencia de topo i, relaja  probremente un dna superenrollado, a una temperatura \u00f3ptima de 52\u00c2\u00b0c (digate and marians,  1988). Junto con la  helicasa recq, topo iii es capaz de resolver horquillas de replicaci\u00f3n  convergentes, y esto se ha demostrado que se realiza por interacci\u00f3n f\u00edsica entre ambas, mediada  por la interacci\u00f3n por separado de cada una de ellas con la prote\u00edna ssb  (suski and marians,  2008). La prote\u00edna m\u00e1s similar a topo iii de b.Subtilis es topo iii\u00edY de bacillus cereus, con la que  presenta un 64% de identidad de secuencia. Esta enzima presenta un m\u00e1ximo de actividad de  relajaci\u00f3n a 52\u00c2\u00bac y ph \u00f3ptimo de 9.8 y no es capaz de relajar totalmente un dna superenrollado  (li et al., 2006). Topo iii\u00edY no es capaz de compensar la p\u00e9rdida de topo iii de e.Coli in vivo, lo  que probablemente indica que se trata de una nueva topoisomerasa con una funci\u00f3n distinta en la  c\u00e9lula. En general, las topoisomerasas tipo iii han sido asociadas a procesos de recombinaci\u00f3n de  dna, como en el caso de topo iii de  e.Coli, la cual podr\u00eda tener un papel  in vivo  como  ruta  alternativa de disoluci\u00f3n de la holliday junction (lopez et al., 2005). El proceso de recombinaci\u00f3n  hom\u00f3loga en  b.Subtilis  es  un  proceso  altamente  organizado. Una de las razones por las que se  activa es como consecuencia de un da\u00f1o en el dna, como roturas de doble cadena. Cuando esto  ocurre,  el da\u00f1o es reconocido y procesado por nucleasas espec\u00edficas, generando un extremo de  cadena sencilla, que ser\u00e1 reconocido por la prote\u00edna central de la recombinaci\u00f3n, reca, que se  encarga del intercambio de cadenas entre dos dna hom\u00f3logos. Como consecuencia de su acci\u00f3n,  se formar\u00e1 un intermediario de recombinaci\u00f3n denominado holliday junction, que deber\u00e1 ser  procesado por el resolvasoma ruvab-recu. De esta forma se generan dos mol\u00e9culas hijas donde  ha ocurrido un intercambio de material gen\u00e9tico para reparar el da\u00f1o. Se desconoce si topo iii  tiene alg\u00fan papel en una ruta alternativa a la resoluci\u00f3n de ruvab-recu (al igual que en e.Coli),  en la cual y con la ayuda de una helicasa tipo recq (recq o recs) la holliday junction ser\u00eda  disuelta y como consecuencia las dos mol\u00e9culas hijas no intercambiar\u00edan material gen\u00e9tico (fig. 9). el proceso de recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga en  b.Subtilis  se  encuentra  asociado  al  de  competencia  celular, con prote\u00ednas que participan en ambos procesos, como reca, ssb, reco, recu y recn.  durante el estado de competencia natural de b.Subtilis, el dna ex\u00f3geno es incorporado al interior  de la c\u00e9lula mediante la maquinaria localizada en la pared celular conocida como prote\u00ednas \u00c2\u00bfcom\u00c2\u00bf.  el dna, que entra en forma de cadena sencilla, es recubierto por ssb y procesado por reca para  comenzar con un evento de recombinaci\u00f3n (chen et al., 2005) uno de los objetivos propuestos para la presente tesis doctoral fue el de dilucidar el papel in vivo de lrpc. Para ello, se determinaron los niveles intracelulares de la prote\u00edna en distintos momentos  del ciclo celular y en diferentes medios de crecimiento. Lrpc presenta una mayor abundancia al  final de la fase exponencial, pero no se encuentran diferencias entre medio rico o medio m\u00ednimo.  los resultados obtenidos descartan que lrpc sea un regulador global en b.Subtilis, inclin\u00e1ndose  m\u00e1s bien hacia un papel en regulaci\u00f3n local. La fusi\u00f3n fluorescente gfp-lrpc ha permitido  determinar la localizaci\u00f3n  in vivo  de  dicha  prote\u00edna.  En  crecimiento  vegetativo,  en  fases  exponencial y estacionaria, lrpc se encuentra formando un patr\u00f3n espec\u00edfico de foci dentro o en  los bordes del nucleoide, y en algunos casos formando agregados coincidentes con el mismo. Esta  localizaci\u00f3n  en foci y no decorando todo el nucleoide, cuyo patr\u00f3n adem\u00e1s var\u00eda seg\u00fan el  crecimiento y medios de cultivo empleados, indica que lrpc puede tener un papel espec\u00edfico  durante el crecimiento celular, presentando una localizaci\u00f3n cercana a los centros de transcripci\u00f3n  situados en la periferia del nucleoide. Sin embargo, en competencia celular, lrpc presenta un  patr\u00f3n de localizaci\u00f3n polar en la c\u00e9lula, lo cual sugiere un rol en transformaci\u00f3n. Esto se ha visto  confirmado con el descenso al 50% en transformaci\u00f3n plasm\u00eddica del mutante nulo  lrpc  en  comparaci\u00f3n con la cepa silvestre. Por lo tanto lrpc podr\u00eda presentar un peque\u00f1o papel en  competencia celular. Los genes lrpc y topb se encuentran localizados en el mismo oper\u00f3n y se  transcriben bajo el mismo promotor. Lrpc estimula la actividad relaxasa de topoisomerasa iii,  aunque no se ha detectado una interacci\u00f3n directa prote\u00edna-prote\u00edna. el gen  topb  de  b.Subtilis  ha  sido  caracterizado  por primera vez. La morfolog\u00eda celular y del  nucleoide del mutante nulo topb no presenta diferencias respecto a la cepa silvestre. El mutante  nulo topb presenta una viabilidad celular muy similar a la de la cepa silvestre tras inducir da\u00f1o por  mms. Sin embargo, tras la inducci\u00f3n de da\u00f1o por dicha droga, la mutaci\u00f3n sencilla  topb combinada con mutaci\u00f3n en algunos genes implicados en rutas presin\u00e1pticas de la recombinaci\u00f3n  (recf, reco, addab  y recj) recuperan parcialmente su viabilidad respecto a la de cada mutante  sencillo por separado m\u00e1s sensible. El doble mutante  recutopb, sin embargo, presenta una  viabilidad m\u00e1s reducida que la del mutante sencillo recu, lo cual lleva a sugerir que ambos genes  se encuentran actuando en la \u00faltima etapa de la recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga participando en distintas  v\u00edas de resoluci\u00f3n. Esta hip\u00f3tesis se ha visto reforzada por el hecho de que el mutante doble  recutopb  presenta  un  mayor  n\u00famero  de  c\u00e9lulas  anucleadas  y  filamentadas  respecto  al  mutante  sencillo recu. Cuando se utiliza otro  compuesto que causa da\u00f1os en el dna como el h2o2, el  mutante sencillo topb presenta una ligera disminuci\u00f3n de la viabilidad celular con respecto a la  cepa silvestre. Los dobles mutantes addabtopb, recftopb y recotopb recuperan parcialmente la  viabilidad celular respecto a la de los mutantes sencillos por separado  addab, recf  y reco. El  doble mutante recqtopb presenta el mismo fenotipo que el mutante sencillo recq, mientras que  recstopb es menos sensible que el mutante sencillo recs, lo cual sugiera que topo iii actuar\u00eda en  la misma ruta que recq y distinta de recs. El doble mutante recutopb  presenta  un  fenotipo  sin\u00e9rgico respecto al mutante sencillo recu, al igual que en presencia de mms. Todos estos datos  llevan a proponer un papel de topoiii en etapas tard\u00edas de la recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga. La fusi\u00f3n  fluorescente topoiii-yfp presenta una localizaci\u00f3n celular citos\u00f3lica o polar, y no se observan  foci espec\u00edficos en los centros de reparaci\u00f3n tras la inducci\u00f3n de da\u00f1o del dna por mmc. La  prote\u00edna topoisomerasa iii de b.Subtilis  ha  sido  purificada  y  caracterizada  por  primera  vez.  Se  trata de una prote\u00edna monom\u00e9rica de 80 kda aproximadamente. La actividad relacionada con  dicha prote\u00edna permite clasificarla como una relaxasa de dna superenrollado, que presenta dicha actividad a ph 9.8 y una temperatura de 52\u00c2\u00bac. Topoiii es capaz de unirse con mayor afinidad a  cualquier tipo de dna en presencia de 1 mm mgcl2. Tambi\u00e9n se une con mayor afinidad a las  estructuras de recombinaci\u00f3n que a un dna de cadena doble o sencilla, indicando un posible  papel en recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga. Topo iii por s\u00ed sola no puede cortar el intermediario de cuatro  cadenas que se produce en recombinaci\u00f3n, la holliday junction, por lo que se estima necesaria la  participaci\u00f3n de una prote\u00edna accesoria para dicha actividad, en caso de que topo iii pudiera  disolver dicha estructura. Sin embargo, topo iii corta espec\u00edficamente el primer intermediario de  recombinaci\u00f3n, producto de la invasi\u00f3n de un dna de cadena sencilla en un dna hom\u00f3logo de  cadena doble (denominado d-loop). las conclusiones obtenidas durante la presente tesis doctoral son: 1. Los niveles proteicos de lrpc no presentan una variaci\u00f3n entre medio rico y medio m\u00ednimo,  pero s\u00ed entre fases de crecimiento, presentando un m\u00e1ximo al final de la fase exponencial. Lrpc no  puede ser considerado un regulador global como su hom\u00f3logo en  e.Coli. Al final de la fase  exponencial en medio rico, lrpc modula la expresi\u00f3n de tan solo 26 genes, lo que supone un 0.6%  del genoma total. 2. La localizaci\u00f3n in vivo de gfp-lrpc durante el crecimiento vegetativo muestra dos patrones  principales, presentando foci discretos o agregados coincidentes con el nucleoide, que a su vez  var\u00edan seg\u00fan el medio de crecimiento empleado. En medio m\u00ednimo en crecimiento exponencial,  gfp-lrpc presenta dos focos sim\u00e9tricos coincidentes con el nucleoide o uno asim\u00e9trico en los  bordes del nucleoide. Este patr\u00f3n de focos est\u00e1 situado m\u00e1s cerca de los polos celulares en  crecimiento estacionario. En medio m\u00ednimo de competencia, gfp-lrpc se  localiza  mayoritariamente en focos polares. 3. Lrpc no es una prote\u00edna reclutada a los centros de reparaci\u00f3n despu\u00e9s de da\u00f1o por mmc. La  localizaci\u00f3n polar de gfp-lrpc en fase de competencia natural permite sugerir un papel en dicho  proceso, confirmado por el defecto en transformaci\u00f3n plasm\u00eddica presentado por el mutante nulo  lrpc.  4. Los genes lrpc y topb de b.Subtilis conforman un \u00fanico oper\u00f3n y por lo tanto son transcritos a  partir del mismo promotor. Lrpc estimula la actividad de relajaci\u00f3n de topo iii, aunque no se  pudo detectar una interacci\u00f3n directa entre ambas. 5. El mutante nulo topb presenta una morfolog\u00eda celular y de nucleoide similar a la cepa silvestre.  el doble mutante recutopb  presenta  3  veces  m\u00e1s  de  c\u00e9lulas  enucleadas  en  comparaci\u00f3n  con  el  mutante sencillo recu.  6. Cuando se introduce un da\u00f1o de dna por mms o por h2o2, la viabilidad celular del mutante  sencillo topb es similar a la de la cepa silvestre. Dobles mutantes de topb con genes presin\u00e1pticos  addab, recj, reco  y recf  recuperan  su  viabilidad  parcialmente respecto a la de los mutantes  sencillos  addab, recj, reco  y  recf, respectivamente. El doble mutante recutopb  presenta  una  mayor sensibilidad al da\u00f1o por mms que el mutante sencillo recu. Topoiii est\u00e1 implicada en  reparaci\u00f3n de dna por recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga, pudiendo desarrollar una actividad  antirecombinasa y de resoluci\u00f3n de d-loops. El an\u00e1lisis gen\u00e9tico parece indicar que topoiii ser\u00eda  epist\u00e1tico con recq, mientras que con recs s\u00f3lo ser\u00eda epist\u00e1tico en caso de da\u00f1o por mms. 7. La fusi\u00f3n topo iii-yfp se encuentra localizada en el citosol celular, a diferencia de recq y  recs que localizan en foci discretos coincidentes con el nucleoide. Topo iii no forma parte de las  prote\u00ednas que son reclutadas a los centros de reparaci\u00f3n tras inducir da\u00f1o por mmc. 8. Topoisomerasa iii de b.Subtilis es un polip\u00e9ptido monom\u00e9rico de 80 kda. Presenta actividad  caracter\u00edstica de relajaci\u00f3n parcial de pl\u00e1smido superenrollado con unas condiciones de 52\u00c2\u00bac y ph  9.8. 9. Topoiii se une a intermediarios de recombinaci\u00f3n con 6 veces m\u00e1s de afinidad que a dna de  cadena doble o sencilla en presencia de mg 2+ . En presencia de edta, topoiii se une con menor  afinidad a estas estructuras. Topoiii no realiza el corte de la hj  in vitro  en  las  condiciones  probadas. 10.Topoiii corta espec\u00edficamente d-loops, intermediarios de recombinaci\u00f3n que se forman  durante la sinapsis. El mutante nulo topb presenta un defecto en transformaci\u00f3n cromosomal que  apoya.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>In vivo and in vitro studies of the lrpc-topb operon of bacillus subtilis.<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 In vivo and in vitro studies of the lrpc-topb operon of bacillus subtilis. <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Esther Patricia Garcia Tirado <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Aut\u00f3noma de Madrid<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 16\/11\/2011<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Silvia Ayora Hirsch<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: jos\u00e9 Berenguer Carlos <\/li>\n<li>enrique Viguera m\u00ednguez (vocal)<\/li>\n<li>eduardo Gonz\u00e1lez pastor (vocal)<\/li>\n<li>graciela Pucciarelli morrone (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Esther Patricia Garcia Tirado El gen lrpc de bacillus subtilis, que ha sido caracterizado como un gen [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"ast-content-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"footnotes":""},"categories":[36483],"tags":[131533,64806,222609,190854,6063,169250],"class_list":["post-111774","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-molecular","tag-eduardo-gonzalez-pastor","tag-enrique-viguera-minguez","tag-esther-patricia-garcia-tirado","tag-graciela-pucciarelli-morrone","tag-jose-berenguer-carlos","tag-silvia-ayora-hirsch"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/111774","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=111774"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/111774\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=111774"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=111774"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=111774"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}