{"id":113249,"date":"2018-03-11T10:40:35","date_gmt":"2018-03-11T10:40:35","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/purification-and-characterization-of-the-structure-and-function-of-a-novel-actinoporin-isolated-from-the-sea-anemone-actinia-fragacea\/"},"modified":"2018-03-11T10:40:35","modified_gmt":"2018-03-11T10:40:35","slug":"purification-and-characterization-of-the-structure-and-function-of-a-novel-actinoporin-isolated-from-the-sea-anemone-actinia-fragacea","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/polipeptidos-y-proteinas\/purification-and-characterization-of-the-structure-and-function-of-a-novel-actinoporin-isolated-from-the-sea-anemone-actinia-fragacea\/","title":{"rendered":"Purification and characterization of the structure and function of a novel actinoporin isolated from the sea anemone actinia fragacea"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Koldobika Morante Sagasti <\/strong><\/h2>\n

En el l\u00edquido exudado de la an\u00e9mona de mar actinia fragacea se encuentra una ampliavariedad de prote\u00ednas t\u00f3xicas, entre las que se encuentran las actinoporinas, prote\u00ednascitol\u00edticas que se caracterizan por tener una masa molecular de aproximadamente 20kda, carecer de ciste\u00ednas en su estructura primaria y tener un pi b\u00e1sico. Su efecto l\u00edticoconsiste en la formaci\u00f3n de un poro transmembranal en las c\u00e9lulas diana que rompe labarrera de permeabilidad y da lugar a la muerte celular por choque osm\u00f3tico. Otracaracter\u00edstica distintiva de las actinoporinas es que su actividad citol\u00edtica resultainhibida por la esfingomielina.Actinia fragacea produce al menos cinco actinoporinas denominadas fragaceatoxina a(fraa), fragaceatoxina b (frab), fragaceatoxina c (frac), fragaceatoxina d (frad) yfragaceatoxina e (frae). Todas ellas son muy similares entre s\u00ed: sus masas molecularesrondan los 19,7 kda, presentan actividad hemol\u00edtica, sus pi son b\u00e1sicos y su estructurasecundaria es fundamentalmente de tipo b, otra caracter\u00edstica distintiva de lasactinoporinas. Estas isoformas no son variantes al\u00e9licas sino que est\u00e1n codificadas portoda una familia de genes carentes de intrones y son, por tanto, prote\u00ednas par\u00e1logas quehan emergido a lo largo de la evoluci\u00f3n mediante un mecanismo basado en unaduplicaci\u00f3n de genes seguida de una evoluci\u00f3n divergente. Este mecanismo es muy \u00fatilpara aumentar la capacidad depredadora de las an\u00e9monas, ya que consigue que susefectos se extiendan a una mayor diversidad de presas. El alineamiento de susestructuras primarias con el de otras actinoporinas y el posterior an\u00e1lisis filogen\u00e9ticoconfirma su pertenencia a esta familia de prote\u00ednas.A\u00fan poseyendo un elevado grado de identidad en sus secuencias, las peque\u00f1asdiferencias que hay entre ellas se traducen en diferencias funcionales m\u00e1s o menosimportantes, tal y como se deduce a partir de los ensayos de hem\u00f3lisis. As\u00ed, hemospodido distinguir dos grupos de fragaceatoxinas: las que presentan una elevadavelocidad hemol\u00edtica (frad y frae) y las que act\u00faan de manera m\u00e1s lenta (fraa, frab yfrac). Esta diferenciaci\u00f3n tambi\u00e9n se ha observado en los resultados obtenidosmediante la t\u00e9cnica de dicro\u00edsmo circular en los que se med\u00eda la variaci\u00f3n en laelipticidad molar de la prote\u00edna a 210 nm en funci\u00f3n de la temperatura: las toxinas conmayor actividad hemol\u00edtica (frad y frae) presentan una termoestabilidad menor (esdecir, se desnaturalizan a temperaturas m\u00e1s bajas) que las toxinas con menor actividadhemol\u00edtica (fraa y frab), que son m\u00e1s termoestables (se desnaturalizan a temperaturasm\u00e1s altas).Cap\u00edtulo 6 resumen y conclusiones190estas diferencias funcionales y estructurales (suponiendo que la distintatermoestabilidad se deba a ligeras diferencias estructurales) puede explicar, a grandesrasgos, el comportamiento de cada isoforma durante su eluci\u00f3n a lo largo de unacolumna cromatogr\u00e1fica de interacci\u00f3n cati\u00f3nica mediante un gradiente deconcentraic\u00f3n de sal: fraa y la frab son las primeras en eluir mientras que frad y fraeeluyen en \u00faltimo lugar. El hecho de que frac aparezca en un volumen de eluci\u00f3nintermedio entre los dos grupos permite predecir que comparte caracter\u00edsticas de ambosgrupos: por un lado, su actividad hemol\u00edtica es baja (como la fraa y la frab) mientrasque, por otro lado, su estabilidad t\u00e9rmica se asemeja m\u00e1s a las de frad y frae.Evidentemente, las diferencias en el comportamiento de las distintas isoformas se debena peque\u00f1as diferencias estructurales ocasionadas por las variaciones en su secuencia deamino\u00e1cidos. Con objeto de poder estudiar la importancia de ciertos amino\u00e1cidos sobrela actividad de la prote\u00edna se obtuvo la forma recombinante de la frac. La prote\u00ednaheter\u00f3loga y la nativa son pr\u00e1cticamente id\u00e9nticas desde el punto de vista estructural yfuncional, tal y como se deduce a partir de los resultados obtenidos en los ensayos conmembranas naturales y membranas modelo y en los ensayos de estabilidad t\u00e9rmica. Laclonaci\u00f3n de frac nos permite dise\u00f1ar mutantes puntuales que nos permitan identificarlos amino\u00e1cidos especialmente importantes para el mantenimiento de la estructura y\/ofunci\u00f3n.La determinaci\u00f3n de la estructura terciaria de una prote\u00edna es de vital importancia paracomprender su mecanismo funcional. Combinando los estudios realizados hasta la fechacon los resultados de nuestros estudios estructurales, tanto de difracci\u00f3n de rayos-xcomo de criomicroscop\u00eda electr\u00f3nica, se puede afirmar que este proceso consta de tresetapas: (1) uni\u00f3n de la prote\u00edna en forma monom\u00e9rica a la membrana de la c\u00e9lula oves\u00edcula, (2) oligomerizaci\u00f3n de los mon\u00f3meros unidos para formar un preporo y (3)inserci\u00f3n del complejo proteico en la membrana.La resoluci\u00f3n a 1,7 \u00ed\u00a5 de la estructura monom\u00e9rica de la frac permite identificaragrupaciones de amino\u00e1cidos implicadas en algunas de estas actividades. As\u00ed, en la zonabasal de la prote\u00edna se agrupan los residuos que participan en el reconocimiento de losl\u00edpidos y en la uni\u00f3n a la membrana diana (ser54, val87, ser105, pro107, tyr108,tyr110, trp112, tyr113, tyr133, tyr137, tyr138). Tambi\u00e9n se pueden identificar losresiduos involucrados en la formaci\u00f3n de enlaces hidrof\u00f3bicos que sujetan la a-h\u00e9licen-terminal (que es la que, en \u00faltima instancia, dar\u00e1 lugar a la formaci\u00f3n del poro) alcuerpo de la prote\u00edna. La estructura terciaria de frac es pr\u00e1cticamente id\u00e9ntica a la deotras actinoporinas como la equinatoxina ii (1iaz) y la esticolisina ii (1gwy), tal ycomo se deduce a partir de los valores de rmsd de los carbonos a, que son 0,4 y 0,5,respectivamente.La obtenci\u00f3n de la estructura cuaternaria de frac a una resoluci\u00f3n de 1,8 \u00ed\u00a5 muestra unnon\u00e1mero con forma de corona. Esta corona tiene un di\u00e1metro externo de 11,2 nm, undi\u00e1metro interno de 5,2 nm y una altura de 4,3 nm. Esta estructura permite detallar lasinteracciones existentes en la interfase prote\u00edna-prote\u00edna que consiguen mantener lacap\u00edtulo 6 resumen y conclusiones191estructura anular del olig\u00f3mero. La interacci\u00f3n principal se da entre la val60 de unprot\u00f3mero y una cavidad del prot\u00f3mero contiguo en la que destaca la agrupaci\u00f3n de losamino\u00e1cidos arom\u00e1ticos phe16, trp149 y phe163. La val60 de un prot\u00f3mero penetraen el interior del bolsillo arom\u00e1tico a modo de conexi\u00f3n \u00abcaja y espiga\u00bb. Si se comparanlas estructuras tridimensionales del mon\u00f3mero de frac y del prot\u00f3mero ensamblado seobserva que esta interacci\u00f3n es posible gracias a un ligero cambio conformacional queafecta a la orientaci\u00f3n de la cadena lateral de la phe16 y que, de este modo, permite elacceso de la val60 a la cavidad hidrof\u00f3bica del prot\u00f3mero adyacente. Este cambio est\u00e1acompa\u00f1ado del desplazamiento de otros dos amino\u00e1cidos de la a-h\u00e9lice n-terminal(asp17 y lys20), lo que, a la postre, reduce el \u00e1rea de contacto entre la regi\u00f3n nterminaly el b-sandwich de la prote\u00edna en unos 45 \u00ed\u00a52. Esta reducci\u00f3n favorecer\u00eda laseparaci\u00f3n de la a-h\u00e9lice n-terminal del sandwich-b y su inserci\u00f3n en la bicapa lip\u00eddica.A su vez, la phe16 est\u00e1 situada en el extremo amino de la a-h\u00e9lice n-terminal y muycerca de la h\u00e9lice 310. El cambio de orientaci\u00f3n de la cadena lateral de este amino\u00e1cidopodr\u00eda resultar clave para la formaci\u00f3n de un segmento a-helicoidal de longitudsuficiente como para atravesar una membrana biol\u00f3gica ya que permitir\u00eda la elongaci\u00f3nde la a-h\u00e9lice n-terminal por su extremo amino y su fusi\u00f3n con la h\u00e9lice 310 adyacente,dando lugar a una \u00fanica a-h\u00e9lice lo suficientemente larga como para atravesar la bicapa.Este mecanismo de inserci\u00f3n guardar\u00eda cierta similitud con el mecanismo descrito parala toxina citolisina a (clya) que se encuentra en algunas cepas de escherichia coli y desalmonella enterica.La comparaci\u00f3n de las estructuras tridimensionales del mon\u00f3mero de frac y delprot\u00f3mero ensamblado revela una segunda zona que tambi\u00e9n sufre cambiosconformacionales: se trata del lazo que contiene los amino\u00e1cidos trp112 y tyr113. Elmovimiento de las cadenas laterales de estos dos amino\u00e1cidos tiene lugar en respuesta ala presencia de una mol\u00e9cula de detergente ldao que se encuentra en la estructuracristalina del olig\u00f3mero. En condiciones biol\u00f3gicas, este cambio estar\u00eda ocasionado porla interacci\u00f3n con determinados l\u00edpidos de la membrana.Para comprobar si la estructura cristalogr\u00e1fica del olig\u00f3mero se corresponde con la quese produce en condiciones fisiol\u00f3gicas se hicieron reconstrucciones tridimensionales defrac insertada en ves\u00edculas de sm:dopc (1:1) a partir de im\u00e1genes bidimensionalesobtenidas mediante criomicroscop\u00eda electr\u00f3nica. Los resultados obtenidos arrojaronunas dimensiones muy parecidas a las de la estructura oligom\u00e9rica cristalizada. Cuandose procesaron las im\u00e1genes imponiendo una simetr\u00eda de orden nueve se consigui\u00f3aumentar la resoluci\u00f3n y obtener las dimensiones del poro funcional, que result\u00f3 tenerun di\u00e1metro de 1,5 nm, algo menor de lo que se puede encontrar en la bibliograf\u00eda de lasactinoporinas (en torno a 2 nm de di\u00e1metro). Tambi\u00e9n se consider\u00f3 la posibilidad de queel poro estuviese formado por ocho o por diez mon\u00f3meros, pero en ambos casos elajuste de \u00e9stos al mapa de densidad electr\u00f3nica no mejoraba el del non\u00e1mero.Partiendo de estos resultados se construy\u00f3, a partir de la estructura cristalogr\u00e1fica delprot\u00f3mero, un modelo de poro en el que las a-h\u00e9lices n-terminales estuvieseninsertadas. El proceso consisti\u00f3 b\u00e1sicamente en alargar la \u00c2\u00bf-h\u00e9lice n-terminal yextenderla hasta formar un \u00e1ngulo de aproximadamente 30\u00c2\u00ba con el plano normal a labicapa. Posteriormente, se aplic\u00f3 una simetr\u00eda de orden nueve a este prot\u00f3meromodificado para generar un modelo del olig\u00f3mero insertado. La estructura resultante esun haz de a-h\u00e9lices muy parecido al que se observa en la estructura tridimensional de laprote\u00edna wza, un transloc\u00f3n de los polisac\u00e1ridos que forman parte de la c\u00e1psulabacteriana de e. Coli.Las im\u00e1genes obtenidas por microscop\u00eda de fuerza at\u00f3mica de los poros formados porfrac en bicapas planas tambi\u00e9n ofrecen la misma disposici\u00f3n hexagonal observadatanto en la estructura cristalogr\u00e1fica como en las micrograf\u00edas obtenidas porcriomiscroscop\u00eda electr\u00f3nica (crio-tem). Adem\u00e1s, las dimensiones del poro son muyparecidas, lo que nos lleva a la conclusi\u00f3n de que el poro que forman las actinoporinasest\u00e1 formado por nueve mon\u00f3meros de prote\u00edna que atraviesan la membrana formandoun barril a-helicoidal del que no forman parte los l\u00edpidos de la membrana. Estosresultados obligan a replantear el modelo de poro toroidal que, a d\u00eda de hoy, es el m\u00e1saceptado por la comunidad cient\u00edficapara una mayor precisi\u00f3n en la determinaci\u00f3n del tama\u00f1o del poro funcional se procedi\u00f3a incubar la prote\u00edna con ves\u00edculas unilamelares gigantes de sm:dopc (1:1) enpresencia de solutos fluorescentes de distintos tama\u00f1os. El tama\u00f1o del porodiscriminar\u00eda la entrada de solutos al interior de la ves\u00edcula en funci\u00f3n de sus radioshidrodin\u00e1micos y esto se podr\u00eda visualizar mediante un microscopio confocal defluorescencia. Los solutos utilizados para el experimento fueron tres: alexa fluor 488(af488), af633 y af680. Los dos primeros, el af488 y el af633 fueron capaces deacceder al interior de los liposomas a trav\u00e9s de los poros formados por frac. El af680,sin embargo, quedaba completamente excluido, probablemente por ser demasiadogrande. La determinaci\u00f3n del tama\u00f1o de estos solutos fluorescentes se llev\u00f3 a cabomediante espectroscop\u00eda de correlaci\u00f3n de fluorescencia. El radio hidrodin\u00e1mico delaf488 y del af633 resultaron ser de 0,54 nm y de 0,77 nm, respectivamente. Eltama\u00f1o del af680 fue imposible de medir debido a la falta de estabilidad de la se\u00f1alfluorescente. Debido a que la masa molecular del af680 (~ 1150 da) es parecida a ladel af633 (~ 1200 da) y considerando que ambas mol\u00e9culas son globulares, el tama\u00f1odebe de ser parecido. Es por tanto que se deduce a partir de esta t\u00e9cnica que el tama\u00f1odel poro funcional deb\u00eda de ser no mucho mayor de 1.54 nm, un valor que se ajustabastante bien a las dimensiones obtenidas por microscop\u00eda electr\u00f3nica.De la observaci\u00f3n y comparaci\u00f3n de la estructura terciaria de frac en estadomonom\u00e9rico y cuando est\u00e1 formando parte del olig\u00f3mero se pudieron identificar dosamino\u00e1cidos que podr\u00edan ser cruciales para el mecanismo de inserci\u00f3n: se trata de laval60 y de la phe16. Para poner de manifiesto su importancia para el mantenimiento dela estructura y\/o funci\u00f3n de frac se dise\u00f1aron diversos mutantes puntuales a partir de lafrac clonada. Los amino\u00e1cidos elegidos para sustituir a la val60 fueron la arginina (r)y la lisina (k), por tener carga positiva, el \u00e1cido glut\u00e1mico (e), por tener carga negativay la fenilalanina (f), por ser arom\u00e1tico. Estas sustituciones puntuales dieron lugar a loscap\u00edtulo 6 resumen y conclusiones mutantes denominados v60r, v60k, v60e y v60f, respectivamente. Por otro lado, sedecidi\u00f3 sustituir la phe16 por la prolina (p). Como este amino\u00e1cido no puede formarparte de una a-h\u00e9lice dar\u00eda lugar a un mutante capaz de oligomerizar pero incapaz deinsertar su a-h\u00e9lice n-terminal. El mutante correspondiente se denomina f16p. Por\u00faltimo, se dise\u00f1\u00f3 otro mutante en esta misma regi\u00f3n n-terminal. El cambio introducidoconsiste en la adici\u00f3n de un segmento extra de 6 histidinas en el extremo amino defrac. Se trata de una modificaci\u00f3n habitual de muchas prote\u00ednas recombinantes, ya quefacilita enormemente su purificaci\u00f3n, que se reduce a una \u00fanica cromatograf\u00eda encolumna a trav\u00e9s de una resina que contiene n\u00edquel.A partir de los resultados obtenidos en monocapas lip\u00eddicas, se deduce que lasmutaciones introducidas en la posici\u00f3n 60 no alteran su interacci\u00f3n inicial con lamembrana diana pero s\u00ed alguna de las etapas posteriores, ya que la inserci\u00f3n de losmutantes en monocapas da lugar a menores incrementos de la presi\u00f3n superficial en elequilibrio.Las mutaciones introducidas en la posici\u00f3n 60 reducen notablemente la actividadhemol\u00edtica de la prote\u00edna, particularmente en el caso de v60e. Sin embargo, losexperimentos de entrecruzamiento indican que estos cambios no impiden laoligomerizaci\u00f3n de frac, como se hab\u00eda supuesto. Como la superficie de contacto entrelos prot\u00f3meros es tan amplia y la complementariedad entre estas superficies es tanelevada, la sustituci\u00f3n de un \u00fanico amino\u00e1cido no basta para evitar la formaci\u00f3n delnon\u00e1mero. Por tanto, la reducci\u00f3n en la actividad permeabilizadora de frac se debe a laalteraci\u00f3n de alguna etapa posterior a la oligomerizaci\u00f3n. La val60 est\u00e1 muyconservada entre las actinoporinas, y si no hay valina el amino\u00e1cido que la sustituye esla isoleucina, cuya cadena lateral es muy parecida (tiene un grupo metileno adicional).Es muy probable que al cambiar la valina por otros amino\u00e1cidos se est\u00e9 interfiriendo enla interacci\u00f3n normal de este residuo con la agrupaci\u00f3n de amino\u00e1cidos arom\u00e1ticospresente en una cavidad perteneciente al prot\u00f3mero adyacente. Con ello se evitar\u00eda o sedificultar\u00eda la elongaci\u00f3n de la a-h\u00e9lice n-terminal de frac de modo que no puedaalcanzar la longitud suficiente como para atravesar una bicapa lip\u00eddica y dar lugar a unporo funcional. La presencia de una \u00e1cido glut\u00e1mico en esta posici\u00f3n es la que m\u00e1sinterfiere con la actividad hemol\u00edtica y la que inhibe por completo la permeabilizaci\u00f3nde ves\u00edculas unilamelares grandes.Las mutaciones que afectan a la regi\u00f3n n-terminal de frac dan lugar a una dr\u00e1sticareducci\u00f3n de su actividad hemol\u00edtica, pero no llegan a anularla del todo. Losexperimentos realizados en monocapas lip\u00eddicas con el mutante f16p y con el mutantecon una cola de 6 histidinas indican que su inserci\u00f3n en la monocapa se ve reducida, yaque se observa una disminuci\u00f3n de la pendiente de la l\u00ednea de regresi\u00f3n de la gr\u00e1fica dpvs. P0. Sin embargo, los incrementos que provocan en la presi\u00f3n superficial tras suincorporaci\u00f3n a la interfase l\u00edquido-aire son mayores. Esta aparente contradicci\u00f3n puededeberse a que en este sistema modelo los mutantes adoptan una conformaci\u00f3n en la quela regi\u00f3n n-terminal no est\u00e1 insertada perpendicularmente a la monocapa sino que sedispone de forma paralela a ella. Esta conformaci\u00f3n podr\u00eda corresponder a la delintermediario m2 que se forma durante el proceso de inserci\u00f3n de las actinoporinas.<\/p>\n

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Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abPurification and characterization of the structure and function of a novel actinoporin isolated from the sea anemone actinia fragacea<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
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  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Purification and characterization of the structure and function of a novel actinoporin isolated from the sea anemone actinia fragacea <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Koldobika Morante Sagasti <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 27\/09\/2012<\/li>\n<\/ul>\n

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    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
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    • Director de la tesis<\/strong>\n
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      • Juan Manuel Gonz\u00e1lez Ma\u00f1as<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
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        • Presidente del tribunal: felix Mar\u00eda Go\u00f1i urcelay <\/li>\n
        • \u00e1lvaro Mart\u00ednez del pozo (vocal)<\/li>\n
        • Martinez caaveiro Jos\u00e9 Manuel (vocal)<\/li>\n
        • ariana Barl\u00ed\u00afc — (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

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