{"id":114223,"date":"2018-03-11T10:42:09","date_gmt":"2018-03-11T10:42:09","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudio-del-mecanismo-de-accion-de-la-toxina-adenilato-ciclasa-de-bordetella-pertussis\/"},"modified":"2018-03-11T10:42:09","modified_gmt":"2018-03-11T10:42:09","slug":"estudio-del-mecanismo-de-accion-de-la-toxina-adenilato-ciclasa-de-bordetella-pertussis","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/bioquimica-molecular\/estudio-del-mecanismo-de-accion-de-la-toxina-adenilato-ciclasa-de-bordetella-pertussis\/","title":{"rendered":"Estudio del mecanismo de acci\u00f3n de la toxina adenilato ciclasa de bordetella pertussis"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Kepa Belloso Uribe <\/strong><\/h2>\n<p>La aparici\u00f3n de nuevas enfermedades infecciosas junto con el resurgimiento de  otras que se cre\u00edan casi erradicadas, as\u00ed como la detecci\u00f3n de resistencias a f\u00e1rmacos  existentes, ha puesto de manifiesto la necesidad e importancia de esclarecer las bases  moleculares de las enfermedades causadas por virus y bacterias. En la presente tesis se  ha  abordado el estudio del mecanismo de acci\u00f3n de  la toxina adenilato ciclasa, uno de  los principales factores de virulencia secretado por bordetella pertussis, la bacteria  causante de la tosferina.   La act es una toxina proteica de gran tama\u00f1o (1706 amino\u00e1cidos) formada por dos dominios, un dominio n-terminal (aminoacidos 1-382) que posee actividad  catal\u00edtica adenilato ciclasa (dominio ac) y un domino c-terminal (\u00c2\u00bf 400-1706) que  posee, cuatro alfa-h\u00e9lices que se unen a membranas y una regi\u00f3n de uni\u00f3n a calcio  (dominio rtx) hom\u00f3loga a otras toxinas hemol\u00edticas pertenecientes a la familia rtx  (repeats in toxin).    La toxina act se une con gran afinidad a las c\u00e9lulas inmunes (macr\u00f3fagos y  neutr\u00f3filos) que expresan en su membrana la integrina \u00c2\u00bfm\u00edY2, actuando como receptor de  la toxina en estas c\u00e9lulas. Tras la uni\u00f3n al receptor, el dominio rtx se inserta en la  membrana de la c\u00e9lula diana y el dominio ac transloca, a trav\u00e9s de la membrana,  generando grandes cantidades de camp bajo la membrana plasm\u00e1tica. Resultados  previos obtenidos en este laboratorio han demostrado que el camp generado induce la  entrada de calcio extracelular a trav\u00e9s de canales de calcio tipo l, v\u00eda activaci\u00f3n de la  proteina kinasa a (pka) celular.    En este trabajo se ha encontrado que la toxina adenilato ciclasa es endocitada  tanto por c\u00e9lulas que expresan la integrina  \u00c2\u00bfm\u00edY2 (macr\u00f3fagos j774a.1 y c\u00e9lulas cho- k1\/cr3+) como por c\u00e9lulas que no expresan este receptor (c\u00e9lulas cho-k1 y  j774a.1\/cr3-). Adem\u00e1s se han observado distintas v\u00edas de entrada que parecen  depender no s\u00f3lo de la presencia o no del receptor sino tambi\u00e9n de la propia fisiolog\u00eda y  caracter\u00edsticas del tipo celular expuesto a la acci\u00f3n de la toxina. As\u00ed, mientras en los  macr\u00f3fagos j774a.1 alrededor de un 80% de la act es internalizada v\u00eda ves\u00edculas de  clatrina, en c\u00e9lulas cho-k1\/cr3+ la proporci\u00f3n de toxina endocitada por esta v\u00eda se  reduce aproximadamente a un 50% y el otro 50% es captado v\u00eda caveolas. En c\u00e9lulas  cho-k1, pr\u00e1cticamente la totalidad de la toxina parece entrar mediante caveolas,  mientras que en c\u00e9lulas j774a.1\/cr3- la toxina es mayoritariamente captada v\u00eda  ves\u00edculas de clatrina, lo cual sugiere que la fisiolog\u00eda espec\u00edfica de la c\u00e9lula y sus  caracter\u00edsticas podr\u00edan determinar la v\u00eda endoc\u00edtica seguida por la act, y que la  integrina cd11b\/cd18 (integrina \u00c2\u00bfm\u00edY2) no se requiere necesariamente para activar la  internalizaci\u00f3n de la act v\u00eda clatrina en macr\u00f3fagos.   Cabe tambi\u00e9n destacar que los inhibidores espec\u00edficos de tirosina quinasas  disminuyen significativamente el porcentaje de internalizaci\u00f3n de la act en los cuatro  tipos celulares ensayados, lo que sugiere que la act podr\u00eda inducir la activaci\u00f3n de  tirosina quinasas de la familia src, que podr\u00edan, a su vez, estar involucradas en la  activaci\u00f3n de las distintas v\u00edas endoc\u00edticas, a trav\u00e9s de la fosforilaci\u00f3n de distintos  componentes implicados en ellas. Esta hip\u00f3tesis se refuerza por la fosforilaci\u00f3n de la  caveolina-1 inducida por act en c\u00e9lulas cho-k1. As\u00ed, la activaci\u00f3n de tirosina quinasas  solubles de la familia src podr\u00edan ser un denominador com\u00fan en las diferentes  estrategias endoc\u00edticas utilizadas por las c\u00e9lulas diana para internalizar la toxina. Con  todo, los resultados obtenidos sugieren que la se\u00f1alizaci\u00f3n celular inducida por la act  en la que participan tirosina quinasas y prote\u00ednas quinasas como la pka dependiente de  camp, podr\u00eda mediar la fosforilaci\u00f3n de diferentes sustratos celulares involucrados en  diferentes v\u00edas endoc\u00edticas. La v\u00eda concreta de se\u00f1alizaci\u00f3n activada por la act podr\u00eda  pues depender de las caracter\u00edsticas y fisiolog\u00eda celulares as\u00ed como de los substratos  celulares espec\u00edficos que resulten fosforilados por la quinasas.   Otro denominador com\u00fan encontrado en la endocitosis de la act por los  distintos tipos celulares es la elevaci\u00f3n de la concentraci\u00f3n intracelular de calcio  inducida por acci\u00f3n de la toxina. Se han descrito respuestas biol\u00f3gicas en las que  participa la endocitosis activada por ca2+ como respuesta de las c\u00e9lulas a rupturas en la  membrana, inducidas tanto por fuerzas mec\u00e1nicas como por distintas prote\u00ednas  formadoras de poro. La toxina formadora de poros grandes slo, la toxina formadora de  poros peque\u00f1os \u00c2\u00bf-toxin, y de poros medianos perforina, desencadenan procesos de endocitosis que se correlacionan con el resellado de la membrana plasm\u00e1tica. En el  presente trabajo se muestra que la membrana plasm\u00e1tica da\u00f1ada por la act es reparada  aproximadamente en 1 hora, tanto en c\u00e9lulas cho-k1 como en cho-k1\/cr3+,  volvi\u00e9ndose progresivamente impermeables a la entrada de ioduro de propidio tras la  adici\u00f3n de la toxina. La buena correlaci\u00f3n entre la escala temporal del proceso de  reparaci\u00f3n de membrana y la internalizaci\u00f3n de la act apoya la hip\u00f3tesis de que la  eliminaci\u00f3n de la toxina de la membrana celular puede formar parte de una respuesta  celular de reparaci\u00f3n de membrana.   Seg\u00fan el modelo actual de actuaci\u00f3n de la act, los efectos citot\u00f3xicos ejercidos  por la toxina sobre las c\u00e9lulas inmunes (inhibici\u00f3n de fagocitosis, inhibici\u00f3n de  quimiotaxis, inhibici\u00f3n de la producci\u00f3n de superoxido, etc.) Est\u00e1n mediados,  fundamentalmente, por la generaci\u00f3n suprafisiol\u00f3gica, justo debajo de la membrana  plasm\u00e1tica, de camp, un importante segundo mensajero para las c\u00e9lulas eucariotas. Sin  embargo, aqu\u00ed se han descrito efectos t\u00f3xicos importantes que tienen lugar lejos de la  membrana como, por ejemplo, la inducci\u00f3n de apoptosis en la mitocondria, o la  activaci\u00f3n de algunos factores de transcripci\u00f3n en el n\u00facleo, los cuales no se explicar\u00edan  bien \u00fanicamente a trav\u00e9s de la generaci\u00f3n submembranal de camp por el dominio ac,  particularmente si se considera la baja difusibilidad del camp en el citosol.    En esta tesis se plante\u00f3 la hip\u00f3tesis de que el dominio catal\u00edtico pudiera ser  escindido tras la translocaci\u00f3n del dominio n-terminal y pudiera actuar a modo de  adenilato ciclasa \u00c2\u00bfsoluble\u00c2\u00bf. Los resultados obtenidos permiten afirmar que, tras la  translocaci\u00f3n del dominio ac a trav\u00e9s de la membrana, la act es escindida  proteol\u00edticamente en macr\u00f3fagos originando dos p\u00e9ptidos catal\u00edticamente activos, de \u00c2\u00bf  40 y 45 kda, correspondientes al dominio n-terminal de la act, que con el tiempo se  localizan en el n\u00facleo y la mitocondria.  Se propone que la proteasa implicada en el corte  podr\u00eda ser la calpa\u00edna celular, una ciste\u00edna proteasa dependiente de calcio que resulta  activada en la c\u00e9lula como consecuencia de la elevaci\u00f3n de calcio intracelular inducida  por la propia toxina. Los ensayos de inhibici\u00f3n tanto farmacol\u00f3gica como por  silenciamiento g\u00e9nico sugieren que la isoforma denominada calpa\u00edna-2 (m-calpa\u00edna) es  principalmente activada en los macr\u00f3fagos incubados con act a las concentraciones  ensayadas, aunque es posible que a concentraciones de toxina inferiores y por tanto, con  incrementos menores de la concentraci\u00f3n intracelular de calcio inducida por la act,  solo se active la isoforma denominada calpa\u00edna-1 (\u00c2\u00bf-calpa\u00edna).    Los resultados obtenidos en los ensayos de corte  in vitro realizados con la toxina  purificada y calpa\u00edna purificada han sido particularmente reveladores. La protecci\u00f3n  conferida por la pre-incubaci\u00f3n de la toxina con calmodulina, que blinda el dominio n- terminal de la toxina de una prote\u00f3lisis masiva mediada por calpa\u00edna,  sugiere que la  calmodulina puede jugar un papel importante como estabilizador estructural del  dominio ac dentro de la c\u00e9lula, adem\u00e1s de actuar como activador de la actividad  adenilato ciclasa. Recientemente, se ha demostrado que el dominio catal\u00edtico purificado  comprendido entre los residuos 1-384 de la act no es muy estable  termodin\u00e1micamente y tiende a la agregaci\u00f3n de una manera dependiente de la  temperatura, mientras que, en presencia de calmodulina, el complejo sufre una  compactaci\u00f3n y deshidrataci\u00f3n significativas. La uni\u00f3n de calmodulina al dominio ac  podr\u00eda pues proveer una estabilidad estructural y\/o blindaje del dominio ac para evitar  un corte prematuro mediado por la proteasa activa,  lo cual asegurar\u00eda la liberaci\u00f3n de  un dominio ac completo y activo al citosol celular. Tras el corte in vitro de la act  purificada se han identificado dos p\u00e9ptidos catal\u00edticamente activos, similares, si no  id\u00e9nticos, a los obtenidos en las fracciones citos\u00f3licas de macr\u00f3fagos, de masas \u00c2\u00bf 45 y 50  kda. El hecho de que el dominio catal\u00edtico (amino\u00e1cidos 1-384) por s\u00ed mismo no  presente ninguna tendencia de asociaci\u00f3n a la membrana y el hecho de que, in vivo, en  macr\u00f3fagos se hayan detectado los fragmentos de 45-50 kda en org\u00e1nulos subcelulares,  plantea la suposici\u00f3n del requerimiento de una secuencia de reconocimiento o regi\u00f3n de  uni\u00f3n a membranas, en la forma \u00c2\u00bfsoluble\u00c2\u00bf del domino ac, que favorezca su migraci\u00f3n y  anclaje a org\u00e1nulos subcelulares. Se ha determinado por espectrometr\u00eda de masas de  fragmentos tr\u00edpticos de los dos fragmentos de prote\u00edna (45 and 50 kda) derivados del  corte in vitro mediado por calpa\u00edna que ambos p\u00e9ptidos se extienden m\u00e1s all\u00e1 del  amino\u00e1cido 384, hasta el residuo 413 en el caso del fragmento de 45 kda, y hasta el  amino\u00e1cido 435 en el caso del fragmento de 50 kda. Muy recientemente karst y  colaboradores (2012) han descrito que la regi\u00f3n 375-485 en la act parece tener un  papel importante en promover la interacci\u00f3n del dominio catal\u00edtico con la membrana  plasm\u00e1tica y su translocaci\u00f3n a trav\u00e9s de la bicapa lip\u00eddica de las c\u00e9lulas diana. Esto  permite especular que el corte proteol\u00edtico de la act mediado por la calpa\u00edna podr\u00eda  liberar una forma \u00c2\u00bfsoluble\u00c2\u00bf del domino ac dotado de capacidad catal\u00edtica y con la  habilidad de asegurar una localizaci\u00f3n y producci\u00f3n de ampc subcelular espec\u00edfica.   Se ha sugerido que el origen de la act pueda encontrarse en la fusi\u00f3n del gen  antecesor de la familia rtx con la adenilato ciclasa eucari\u00f3tica regulada por  calmodulina. Recientemente, se ha descubierto la presencia de adenilato ciclasas  citos\u00f3licas \u00c2\u00bfsolubles\u00c2\u00bf (sac) en c\u00e9lulas de mam\u00edfero, que son distintas evolutiva,  estructural y bioqu\u00edmicamente de las adenilato ciclasas transmembranales sensibles a  prote\u00ednas g. Esas sac se asocian con varios org\u00e1nulos intracelulares, incluidos las  mitocondrias, los centriolos, el huso mit\u00f3tico y los n\u00facleos, donde estimulan distintas  v\u00edas de se\u00f1alizaci\u00f3n dependientes de ampc como la fosforilaci\u00f3n de creb o la apoptosis  dependiente de mitocondrias. A la vista de los resultados presentados es tentador  especular que el componente enzim\u00e1tico de la act podr\u00eda provenir de una de estas  formas solubles de adenilato ciclasas. Esta idea es apoyada por el hecho de que en  presencia  de hco3-, un activador conocido de las acs, la actividad de los fragmentos de  45 y 50 kda derivados del corte in vitro mediado por la calpa\u00edna se ve aumentada  significativamente, y en presencia del inhibidor kh7, espec\u00edfico de acs, la actividad de  esos fragmentos es inhibida de manera significativa.      Escindidaproteol\u00edticamenteenmacr\u00f3fagosoriginandodosp\u00e9ptidoscatal\u00edticamenteactivos,de\u00c2\u00bf40y45kda,correspondientesaldominion-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bfterminaldelaact,queconeltiemposelocalizaneneln\u00facleoylamitocondria.Seproponequelaproteasaimplicadaenelcortepodr\u00edaserlacalpa\u00ednacelular,unaciste\u00ednaproteasadependientedecalcioqueresultaactivadaenlac\u00e9lulacomoconsecuenciadelaelevaci\u00f3ndecalciointracelularinducidaporlapropiatoxina.Losensayosdeinhibici\u00f3ntantofarmacol\u00f3gicacomoporsilenciamientog\u00e9nicosugierenquelaisoformadenominadacalpa\u00edna-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf2(m-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bfcalpa\u00edna)esprincipalmenteactivadaenlosmacr\u00f3fagosincubadosconactalasconcentracionesensayadas,aunqueesposiblequeaconcentracionesdetoxinainferioresyportanto,conincrementosmenoresdelaconcentraci\u00f3nintracelulardecalcioinducidaporlaact,soloseactivelaisoformadenominadacalpa\u00edna-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf1(\u00c2\u00bf-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bfcalpa\u00edna).Losresultadosobtenidosenlosensayosdecorteinvitrorealizadosconlatoxinapurificadaycalpa\u00ednapurificadahansidoparticularmentereveladores.Laprotecci\u00f3nconferidaporlapre-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bfincubaci\u00f3ndelatoxinaconcalmodulina,queblindaeldominion-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bfterminaldelatoxinadeunaprote\u00f3lisismasivamediadaporcalpa\u00edna,sugierequelacalmodulinapuedejugarunpapelimportantecomoestabilizadorestructuraldeldominioacdentrodelac\u00e9lula,adem\u00e1sdeactuarcomoactivadordelaactividadadenilatociclasa.Recientemente,sehademostradoqueeldominiocatal\u00edticopurificadocomprendidoentrelosresiduos1-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf384delaactnoesmuyestabletermodin\u00e1micamenteytiendealaagregaci\u00f3ndeunamaneradependientedelatemperatura,mientrasque,enpresenciadecalmodulina,elcomplejosufreunacompactaci\u00f3nydeshidrataci\u00f3nsignificativas.Launi\u00f3ndecalmodulinaaldominioacpodr\u00edapuesproveerunaestabilidadestructuraly\/oblindajedeldominioacparaevitaruncorteprematuromediadoporlaproteasaactiva,locualasegurar\u00edalaliberaci\u00f3ndeundominioaccompletoyactivoalcitosolcelular.Traselcorteinvitrodelaactpurificadasehanidentificadodosp\u00e9ptidoscatal\u00edticamenteactivos,similares,sinoid\u00e9nticos,alosobtenidosenlasfraccionescitos\u00f3licasdemacr\u00f3fagos,demasas\u00c2\u00bf45y50kda.Elhechodequeeldominiocatal\u00edtico(amino\u00e1cidos1-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf384)pors\u00edmismonopresenteningunatendenciadeasociaci\u00f3nalamembranayelhechodeque,invivo,enmacr\u00f3fagossehayandetectadolosfragmentosde45-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf50kdaenorg\u00e1nulossubcelulares,plantealasuposici\u00f3ndelrequerimientodeunasecuenciadereconocimientooregi\u00f3ndeuni\u00f3namembranas,enlaforma\u00c2\u00bfsoluble\u00c2\u00bfdeldominoac,quefavorezcasumigraci\u00f3nyanclajeaorg\u00e1nulossubcelulares.Sehadeterminadoporespectrometr\u00edademasasdefragmentostr\u00edpticosdelosdosfragmentosdeprote\u00edna(45and50kda)derivadosdelcorteinvitromediadoporcalpa\u00ednaqueambosp\u00e9ptidosseextiendenm\u00e1sall\u00e1delamino\u00e1cido384,hastaelresiduo413enelcasodelfragmentode45kda,yhastaelamino\u00e1cido435enelcasodelfragmentode50kda.Muyrecientementekarstycolaboradores(2012)handescritoquelaregi\u00f3n375-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf485enlaactparecetenerunpapelimportanteenpromoverlainteracci\u00f3ndeldominiocatal\u00edticoconlamembranaplasm\u00e1ticaysutranslocaci\u00f3natrav\u00e9sdelabicapalip\u00eddicadelasc\u00e9lulasdiana.Estopermiteespecularqueelcorteproteol\u00edticodelaactmediadoporlacalpa\u00ednapodr\u00edaliberarunaforma\u00c2\u00bfsoluble\u00c2\u00bfdeldominoacdotadodecapacidadcatal\u00edticayconlahabilidaddeasegurarunalocalizaci\u00f3nyproducci\u00f3ndeampcsubcelularespec\u00edfica.Sehasugeridoqueelorigendelaactpuedaencontrarseenlafusi\u00f3ndelgenantecesordelafamiliartxconlaadenilatociclasaeucari\u00f3ticareguladaporcalmodulina.Recientemente,sehadescubiertolapresenciadeadenilatociclasascitos\u00f3licas\u00c2\u00bfsolubles\u00c2\u00bf(sac)enc\u00e9lulasdemam\u00edfero,quesondistintasevolutiva,estructuralybioqu\u00edmicamentedelasadenilatociclasastransmembranalessensiblesaprote\u00ednasg.Esassacseasocianconvariosorg\u00e1nulosintracelulares,incluidoslasmitocondrias,loscentriolos,elhusomit\u00f3ticoylosn\u00facleos,dondeestimulandistintasv\u00edasdese\u00f1alizaci\u00f3ndependientesdeampccomolafosforilaci\u00f3ndecrebolaapoptosisdependientedemitocondrias.Alavistadelosresultadospresentadosestentadorespecularqueelcomponenteenzim\u00e1ticodelaactpodr\u00edaprovenirdeunadeestasformassolublesdeadenilatociclasas.Estaideaesapoyadaporelhechodequeenpresenciadehco3-\u00c2\u00ad\u00c2\u00bf,unactivadorconocidodelasacs,laactividaddelosfragmentosde45y50kdaderivadosdelcorteinvitromediadoporlacalpa\u00ednaseveaumentadasignificativamente,yenpresenciadelinhibidorkh7,espec\u00edficodeacs,laactividaddeesosfragmentosesinhibidademanerasignificativa<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudio del mecanismo de acci\u00f3n de la toxina adenilato ciclasa de bordetella pertussis<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudio del mecanismo de acci\u00f3n de la toxina adenilato ciclasa de bordetella pertussis <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Kepa Belloso Uribe <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 31\/05\/2013<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Helena Ostolaza Etxabe<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: felix Mar\u00eda Go\u00f1i urcelay <\/li>\n<li>marita Hern\u00e1ndez garrido (vocal)<\/li>\n<li>esteban Veiga chacon (vocal)<\/li>\n<li>M\u00aa Luisa Nieto callejo (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Kepa Belloso Uribe La aparici\u00f3n de nuevas enfermedades infecciosas junto con el resurgimiento de otras que se 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