{"id":115203,"date":"2018-03-11T10:43:36","date_gmt":"2018-03-11T10:43:36","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/lentiviral-mediated-selection-of-midbrain-dopamine-neurons-derived-from-pluripotent-cells-based-on-the-expression-of-the-forkhead-transcription-factor-foxa2\/"},"modified":"2018-03-11T10:43:36","modified_gmt":"2018-03-11T10:43:36","slug":"lentiviral-mediated-selection-of-midbrain-dopamine-neurons-derived-from-pluripotent-cells-based-on-the-expression-of-the-forkhead-transcription-factor-foxa2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/biologia-celular\/lentiviral-mediated-selection-of-midbrain-dopamine-neurons-derived-from-pluripotent-cells-based-on-the-expression-of-the-forkhead-transcription-factor-foxa2\/","title":{"rendered":"Lentiviral mediated selection of midbrain dopamine neurons derived from pluripotent cells based on the expression of the forkhead transcription factor foxa2"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Julio Cesar Aguila Benitez <\/strong><\/h2>\n

La enfermedad de parkinson se caracteriza por la degeneraci\u00f3n y muerte selectiva de las neuronas dopamin\u00e9rgicas en la substantia nigra (aguila et al., 2012). La p\u00e9rdida de esta poblaci\u00f3n celular trae como consecuencia un d\u00e9ficit de dopamina en el estriado generando los trastornos motores caracter\u00edsticos de la enfermedad tales como temblor, rigidez, bradicinesia, entre otros (aguila et al., 2012). La terapia celular basada en trasplantes de tejido mesencef\u00e1lico ha sido empleada en la enfermedad de parkinson (mendez et al., 2008, lindvall and bjorklund, 2011). Algunos de los pacientes trasplantados han mostrado una mejor\u00eda considerable de los s\u00edntomas motores (kefalopoulou et al., 2013), sin embargo la poca disponibilidad de esta fuente celular y los aspectos \u00e9ticos asociados a su uso constituyen una limitaci\u00f3n importante. Adicionalmente, pacientes trasplantados con esta fuente celular han manifestado complicaciones motoras conocidas como discinesias inducidas por el trasplante (gid, de sus siglas en ingles); frecuentemente relacionado con la presencia de neuronas seroton\u00e9rgicas (brundin et al., 2010, aguila et al., 2012). Esto evidencia la escasa estandarizaci\u00f3n del tejido mesencef\u00e1lico a trasplantar y una composici\u00f3n celular heterog\u00e9nea donde solo alrededor de un 5 % representa neuronas dopamin\u00e9rgicas (silani et al., 1994, brundin et al., 2010, aguila et al., 2012).Las c\u00e9lulas pluripotentes, por su capacidad de autorenovaci\u00f3n y potencialidad para dar lugar a cualquier tipo celular son una fuente atractiva e ilimitada, al menos en teor\u00eda. Sin embargo, estas propiedades tambi\u00e9n complican la posibilidad de generar in vitro una poblaci\u00f3n celular homog\u00e9nea. El establecimiento de protocolos de diferenciaci\u00f3n dopamin\u00e9rgica a partir de fuentes pluripotentes y su capacidad para2integrarse y revertir s\u00edntomas motores en distintos modelos de parkinson ha generado gran expectativa con vistas a su posible aplicaci\u00f3n cl\u00ednica (lee et al., 2000, hedlund et al., 2008, sanchez-pernaute et al., 2008, kriks et al., 2011, ganat et al., 2012, xi et al., 2012). Sin embargo, su empleo en la medicina regenerativa est\u00e1 condicionada a la capacidad para desarrollar protocolos de diferenciaci\u00f3n m\u00e1s eficientes en combinaci\u00f3n con m\u00e9todos de selecci\u00f3n (pruszak et al., 2007, hedlund et al., 2008, aguila et al., 2012, ganat et al., 2012).En este sentido, el trabajo realizado en esta tesis se ha dirigido a desarrollar una estrategia de selecci\u00f3n de las neuronas dopamin\u00e9rgicas mesencef\u00e1licas derivadas de fuentes pluripotentes basada en la expresi\u00f3n de foxa2. Este marcador es un factor de transcripci\u00f3n expresado por las neuronas dopamin\u00e9rgicas mesencef\u00e1licas de forma temprana durante el desarrollo embrionario y juega un papel esencial en su especificaci\u00f3n y diferenciaci\u00f3n (ferri et al., 2007, kittappa et al., 2007). Su expresi\u00f3n, restringida a este grupo de neuronas dopamin\u00e9rgicas, se mantiene durante el desarrollo en el adulto regulando su identidad y supervivencia (kittappa et al., 2007, stott et al., 2013).Para la selecci\u00f3n de neuronas de neuronas dopamin\u00e9rgicas mesencef\u00e1licas derivadas de fuentes pluripotentes, hemos desarrollado vectores lentivirales que expresan diferentes reporteros controlados por dos secuencias promotoras del gen de foxa2. Una de las secuencias reguladoras incluye el promotor de 400pb del gen foxa2 y la otra secuencia contiene adicionalmente 1200pb del primer intr\u00f3n y ex\u00f3n (no codificantes). Para comprobar la especificidad de estos vectores utilizamos l\u00edneas celulares humanas y murinas con expresi\u00f3n diferencial de foxa2 y como genes reporteros la prote\u00edna fluorescente verde (gfp) o el gen de resistencia a3puromicina (pac). En estos experimentos de selectividad, solamente el vector lentiviral que incluye la secuencia promotora de 400pb result\u00f3 funcional, espec\u00edfico y sensible a la expresi\u00f3n end\u00f3gena de foxa2 para regular la expresi\u00f3n del gen reportero; demostrando ser una herramienta \u00fatil y flexible para la selecci\u00f3n de c\u00e9lulas foxa2pos.Como requisito indispensable para la validaci\u00f3n y selecci\u00f3n de neuronas foxa2pos, primero confirmamos la expresi\u00f3n end\u00f3gena de este factor de transcripci\u00f3n en progenitores mesencef\u00e1licos ventrales y neuronas dopamin\u00e9rgicas derivadas de c\u00e9lulas pluripotentes murinas, recapitulando in vitro el desarrollo embrionario de las neuronas dopamin\u00e9rgicas mesencef\u00e1licas. Luego verificamos la especificidad de este vector en dicho contexto neuronal, ratificando su versatilidad para seleccionar poblaciones foxa2pos derivadas de cualquier fuente celular.En primer lugar empleamos los lentivirus para la selecci\u00f3n de neuronas dopamin\u00e9rgicas derivadas de c\u00e9lulas embrionarias murinas. En este contexto, utilizamos el vector foxa2.Pac para seleccionar con puromicina progenitores neurales murinos que expresan foxa2. Sin embargo, el uso de puromicina como paradigma de selecci\u00f3n mostr\u00f3 un alto grado de toxicidad por lo cual el resto de los experimentos los realizamos con el vector foxa2.Gfp en combinaci\u00f3n con separaci\u00f3n celular por facs (fluorescence-activated cell sorting).Durante la infecci\u00f3n y selecci\u00f3n por facs, en algunos experimentos empleamos como control otro vector lentiviral que expresa de forma constitutiva la gfp (cmv.Gfp). Con este vector, optimizamos la transducci\u00f3n y pudimos evaluar la capacidad de la fracci\u00f3n celular gfppos seleccionada para integrarse y sobrevivir en el cerebro de ratas hemiparkinsonianas, previamente lesionadas con 6-hydroxidopamina. En4este experimento de trasplante celular, result\u00f3 evidente la necesidad de eliminar durante la selecci\u00f3n las c\u00e9lulas indiferenciadas que permanecen proliferando en el cultivo. Para conseguirlo optimizamos un marcaje extracelular para ssea1, una prote\u00edna de membrana de las c\u00e9lulas embrionarias murinas, que durante el proceso de facs descartamos en las fracciones gfp. Dichas fracciones post-facs mostraron un alto grado de pureza y se caracterizaron de forma inmediata por pcr cuantitativa e immunofluorescencia. La flexibilidad de este vector y su capacidad para enriquecer una poblaci\u00f3n foxa2posgfppos derivada de c\u00e9lulas pluripotentes murinas nos motiv\u00f3 a investigar su utilidad para seleccionar progenitores dopamin\u00e9rgicos derivados de c\u00e9lulas pluripotentes humanas, una fuente celular con aplicaciones m\u00e1s relevantes.Para la diferenciaci\u00f3n dopamin\u00e9rgica derivada de c\u00e9lulas embrionarias humanas, empleamos factores que favorecen de forma eficiente la inducci\u00f3n neural con una identidad regional t\u00edpica del mesenc\u00e9falo ventral, donde se originan las neuronas dopamin\u00e9rgicas (perrier et al., 2004, sanchez-pernaute et al., 2008, kriks et al., 2011). De forma similar a los progenitores neurales murinos, la transducci\u00f3n lentiviral de progenitores neurales humanos con el vector foxa2.Gfp se realiz\u00f3 alrededor de la cuarta semana in vitro (estadio de expansi\u00f3n).La especificidad de este vector en un contexto neuronal humano y su utilidad para seleccionar poblaciones foxa2pos se comprob\u00f3 en diferentes l\u00edneas pluripotentes que dan lugar a neuronas dopamin\u00e9rgicas mesencef\u00e1licas en los estadios m\u00e1s avanzados de diferenciaci\u00f3n. La caracterizaci\u00f3n de las fracciones gfp a partir de la selecci\u00f3n por facs se realiz\u00f3 de forma inmediata por pcr cuantitativa en la mayor\u00eda de los experimentos. En otros casos, pudimos caracterizar por5immunofluorescencia las fracciones gfp mantenidas in vitro a partir de co-cultivos con astrocitos estriatales irradiados, los cuales mejoran la viabilidad post-facs (hedlund et al., 2008).Como resultado de la selecci\u00f3n por facs, la fracci\u00f3n gfppos de progenitores murinos y humanos transducidos con el vector foxa2.Gfp, mostr\u00f3 un enriquecimiento para marcadores mesencef\u00e1licos ventrales. Sin embargo, con esta estrategia no purificamos ninguna poblaci\u00f3n neuronal sino que enriquecemos en una poblaci\u00f3n foxa2pos con un fenotipo de placa basal mesencef\u00e1lica, con expresi\u00f3n de marcadores t\u00edpicos de esta regi\u00f3n que adem\u00e1s de foxa1\/2, incluyen mol\u00e9culas como netrina y f-espondina.Finalmente, empleamos un vector retroviral para sobre expresar foxa2 en progenitores neurales humanos como una estrategia alternativa para validar nuestro paradigma de selecci\u00f3n basado en la expresi\u00f3n end\u00f3gena de foxa2. En estos experimentos comprobamos que la selecci\u00f3n de c\u00e9lulas humanas sobre-expresando foxa2 genera una poblaci\u00f3n enriquecida en marcadores mesencef\u00e1licos ventrales similar a la obtenida con el vector basado en la expresi\u00f3n end\u00f3gena. Estos resultados descartan que la incapacidad del promotor foxa2 (400pb) para enriquecer en neuronas dopamin\u00e9rgicas durante la selecci\u00f3n end\u00f3gena sea debida a causa t\u00e9cnicas. Adicionalmente, el cultivo prolongado de c\u00e9lulas transducidas para sobre-expresar foxa2 y mantenidas en condiciones de diferenciaci\u00f3n terminal, tambi\u00e9n dio lugar a una poblaci\u00f3n mayoritaria de progenitores mesencef\u00e1licos ventrales con caracter\u00edsticas de radial-glia.De forma conjunta, nuestros resultados sugieren que el factor de transcripci\u00f3n foxa2 no es suficiente para seleccionar neuronas dopamin\u00e9rgicas derivadas de c\u00e9lulas pluripotentes. Sin embargo, este vector lentiviral es una herramienta \u00fatil para seleccionar poblaciones6foxa2pos derivadas de cualquier fuente pluripotente, incluidas las ipscs (induced pluripotent stem cells); enriqueciendo un fenotipo de placa basal que permitir\u00eda el estudio in vitro de importantes funciones biol\u00f3gicas del desarrollo como la ventralizaci\u00f3n tisular del tubo neural, el posicionamiento y diferenciaci\u00f3n neuronal e incluso la generaci\u00f3n de organoides neurales de forma m\u00e1s homog\u00e9nea y estructurada.<\/p>\n

 <\/p>\n

Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abLentiviral mediated selection of midbrain dopamine neurons derived from pluripotent cells based on the expression of the forkhead transcription factor foxa2<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
    \n
  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Lentiviral mediated selection of midbrain dopamine neurons derived from pluripotent cells based on the expression of the forkhead transcription factor foxa2 <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Julio Cesar Aguila Benitez <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 31\/01\/2014<\/li>\n<\/ul>\n

     <\/p>\n

    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
      \n
    • Director de la tesis<\/strong>\n
        \n
      • Rosario Sanchez Pernaute<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
          \n
        • Presidente del tribunal: Carlos Matute almau <\/li>\n
        • kausalia Vijayaragavan — (vocal)<\/li>\n
        • trist\u00e1n Rodrigu\u00e9z farningham (vocal)<\/li>\n
        • rosario Moratalla villalba (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

           <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

          Tesis doctoral de Julio Cesar Aguila Benitez La enfermedad de parkinson se caracteriza por la degeneraci\u00f3n y muerte selectiva de […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"ast-content-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"footnotes":""},"categories":[849,962,12909],"tags":[10024,228021,228022,72683,88087,146549],"class_list":["post-115203","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-celular","category-genetica","category-pais-vasco-euskal-herriko-unibertsitatea","tag-carlos-matute-almau","tag-julio-cesar-aguila-benitez","tag-kausalia-vijayaragavan","tag-rosario-moratalla-villalba","tag-rosario-sanchez-pernaute","tag-tristan-rodriguez-farningham"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/115203","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=115203"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/115203\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=115203"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=115203"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=115203"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}