{"id":117042,"date":"2018-03-11T10:46:27","date_gmt":"2018-03-11T10:46:27","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/microspheres-and-nanoparticles-to-release-rhegf-as-an-advanced-approach-for-skin-regeneration\/"},"modified":"2018-03-11T10:46:27","modified_gmt":"2018-03-11T10:46:27","slug":"microspheres-and-nanoparticles-to-release-rhegf-as-an-advanced-approach-for-skin-regeneration","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/evaluacion-de-farmacos\/microspheres-and-nanoparticles-to-release-rhegf-as-an-advanced-approach-for-skin-regeneration\/","title":{"rendered":"Microspheres and nanoparticles to release rhegf as an advanced approach for skin regeneration"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Garazi Gainza Luzea <\/strong><\/h2>\n<p>Las heridas cr\u00f3nicas, definidas como, aquellas heridas cuyo proceso de cicatrizaci\u00f3n se ve retrasado en el tiempo, representan una epidemia silente que afecta a un amplio sector de la poblaci\u00f3n, a la vez que constituye un reto para la salud p\u00fablica y un desaf\u00edo econ\u00f3mico. En este sentido, la administraci\u00f3n de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento epid\u00e9rmico (rhegf), resulta una estrategia prometedora para el tratamiento de este tipo de lesiones. No obstante, debido a la inestabilidad que presentan este tipo de mol\u00e9culas proteicas en la zona de la lesi\u00f3n, la administraci\u00f3n de factores de crecimiento que est\u00e1n involucrados en el proceso de cicatrizaci\u00f3n ha mostrado un \u00e9xito moderado. No obstante, con el objetivo de mejorar la eficacia de los tratamientos actuales basados en la administraci\u00f3n de factores de crecimiento, la comunidad cient\u00edfica est\u00e1 desarrollando nuevas formulaciones que permitan su administraci\u00f3n de forma m\u00e1s efectiva.Es por eso que en la introducci\u00f3n de la tesis se hace una extensa revisi\u00f3n de los actuales sistemas de liberaci\u00f3n de factores de crecimiento, haciendo especial hincapi\u00e9 en las micro y nanoesferas polim\u00e9ricas, nanopart\u00edculas lip\u00eddicas, nanofibras, hidrogeles y soportes s\u00f3lidos. Adem\u00e1s, en esta revisi\u00f3n se resumen los modelos animales actuales disponibles para la cicatrizaci\u00f3n de heridas y los ensayos cl\u00ednicos y los medicamentos comercializados basados en la administraci\u00f3n de factores de crecimiento indicados para el tratamiento de heridas cr\u00f3nicas.En base a lo anteriormente expuesto, el objetivo general de la presente tesis doctoral es desarrollar una nueva formulaci\u00f3n del rhegf basada en micro y nanopart\u00edculas que permita mejorar la eficacia de la formulaci\u00f3n comercial heberprot\u00c2\u00ae (polvo liofilizado que contiene 75 \u00c2\u00b5g de rhegf que se administra de forma intralesional tres veces por semana).El trabajo experimental realizado para alcanzar este objetivo se divide en cuatro cap\u00edtulos diferentes. Cap\u00edtulo 1:el primer cap\u00edtulo de esta tesis doctoral tuvo como objetivo dise\u00f1ar un sistema de liberaci\u00f3n novedoso que permitiera la reducci\u00f3n de la frecuencia de administraci\u00f3n y la dosis total administrada de rhegf  en comparaci\u00f3n con el heberprot\u00c2\u00ae ya comercializado. Para ello, se decidi\u00f3 encapsular el rhegf en microesferas (ms) polim\u00e9ricas biodegradables y biocompatibles.Las microesferas se prepararon utilizando la t\u00e9cnica de doble emulsi\u00f3n\/evaporaci\u00f3n-extracci\u00f3n del solvente. En primer lugar, tan solo se utiliz\u00f3 el \u00e1cido polil\u00e1ctico-co-glic\u00f3lico (plga) como pol\u00edmero en la preparaci\u00f3n de las ms. No obstante, debido a la baja eficacia de encapsulaci\u00f3n (ee) que demostraron tener estas ms, por un lado, se incorpor\u00f3 nacl  en el m\u00e9todo de preparaci\u00f3n, para aumentar la presi\u00f3n osm\u00f3tica de la soluci\u00f3n de tensioactivo y de la soluci\u00f3n utilizada para la eliminaci\u00f3n del disolvente org\u00e1nico, a fin de mejorar las propiedades de las ms. Este paso impidi\u00f3 la difusi\u00f3n del f\u00e1rmaco desde la ms al hacer la superficie ms m\u00e1s suave y m\u00e1s regular; haciendo que la ee se viera aumentada. Por otro lado, tambi\u00e9n se incluyo el alginato, un polisac\u00e1rido natural con una estructura qu\u00edmica similar a los componentes de la matriz extracelular (ecm), en la fase acuosa interna de la emulsi\u00f3n para aumentar la viscosidad de la misma. De este modo, se limit\u00f3 la difusi\u00f3n del rhegf de la ms y el aument\u00f3 ee. Una vez preparadas las microsesferas, estas fueron esterilizadas por radiaci\u00f3n gamma para su posterior administraci\u00f3n in vivo.Los estudios in vitro llevados a cabo en fibroblasto de rat\u00f3n balb\/c 3t3 demostraron que la bioactiviadad del rhegf no se ve\u00eda comprometida ni despu\u00e9s del proceso de encapsulaci\u00f3n ni tras la esterilizaci\u00f3n gamma. Adem\u00e1s, los estudios de migraci\u00f3n celular tambi\u00e9n indicaron que la actividad del egf no se ve\u00eda afectada tras la encapsulaci\u00f3n debido a que la herida creada en el estudio de migraci\u00f3n cerr\u00f3 m\u00e1s r\u00e1pido en aquellas c\u00e9lulas tratadas con egf que en el grupo control.Finalmente, se evalu\u00f3 la eficacia de una \u00fanica administraci\u00f3n intralesional de ms de rhegf en un modelo de herida escisi\u00f3n total en ratas wistar diabetizadas.  Los resutados demostraron que las rhegf ms eran m\u00e1s eficaces promoviendo la cicatrizaci\u00f3n en t\u00e9rminos de porcentaje de cierre de herida, re-epitelizaci\u00f3n y resoluci\u00f3n del estado inflamatorio que 5 dosis de rhegf no-encapsulado.Cap\u00edtulo 2:en el segundo cap\u00edtulo de esta tesis doctoral se desarrollaron nuevas formulaciones que permitieron una administraci\u00f3n eficaz del rhegf a trav\u00e9s de v\u00edas de administraci\u00f3n menos invasivas, como la v\u00eda t\u00f3pica. La administraci\u00f3n t\u00f3pica es una ruta m\u00e1s c\u00f3moda e indolora que puede reducir los efectos sist\u00e9micos adversos debido a la menor biodisponibilidad sist\u00e9mica del f\u00e1rmaco. Para ello, se desarrollaron por un lado, nanopart\u00edculas lip\u00eddicas s\u00f3lidas cargadas con rhegf (rhegf-sln) y por el otro, transportadores lip\u00eddicos nanoestructurados cargados con rhegf (nlc-rhegf).Los resultados in vitro llevados a cabo en fibroblastos de rat\u00f3n balb\/c 3t3, fibroblasts humanos dermales y queratinocitos humanos revelaron que, ni el proceso de encapsulaci\u00f3n, ni el de esterilizaci\u00f3n terminal por gamma afectaba la bioactividad del rhegf. Adem\u00e1s, es importante destacar, que estos estudios demostraron que el proceso de encapsulaci\u00f3n no solo no afectaba la actividad biol\u00f3gica del factor de crecimiento sino que lo mejoraba significativamente. Estos resultados pueden deberse a que tanto las sln-rhegf como las nlc-rhegf pueden unirse de forma continuada al receptor de egf de la superficie celular (regf) y activar la v\u00eda de se\u00f1alizaci\u00f3n, lo que resulta en una mejora de la proliferaci\u00f3n celular. Adem\u00e1s, la internalizaci\u00f3n de estas np en fibroblastos y queratinocitos podr\u00eda estar tambi\u00e9n directamente relacionada con el aumento de la proliferaci\u00f3n celular, ya que, la internalizaci\u00f3n np pueden afectar significativamente al crecimiento y diferenciac\u00f3n celular.Finalmente, se eval\u00fao la eficacia in vivo de dos administraciones t\u00f3picas semanales de 10 y 20 \u00c2\u00bfg de rhegf-sln y rhegf-nlc en comparaci\u00f3n con una sola administraci\u00f3n intralesional de 75 \u00c2\u00bfg rhegf-ms y dos administraciones intralesionales semanales de 75 \u00c2\u00bfg rhegf libre en ratones transg\u00e9nicos db\/ db que tienen las cicatrizaci\u00f3n impedida.  Estos resultados demostraron que cuatro dosis t\u00f3picas de 10 o 20 \u00c2\u00bfg de sln-rhegf o nlc-rhegf eran m\u00e1s efectivas promoviendo la cicatrizaci\u00f3n que el mismo n\u00famero de administraciones intralesionales de 75 \u00c2\u00bfg de rhegf libre, e igualmente efectivas que una \u00fanica administraci\u00f3n intralesional de 75 \u00c2\u00bfg de ms-rhegf.Cap\u00edtulo 3:despu\u00e9s de los buenos resultados obtenidos en ratones db\/db con las nanopart\u00edculas de rhegf del anterior cap\u00edtulo, el siguiente objetivo fue demostrar la eficacia de los nanoformulaciones en un modelo precl\u00ednico m\u00e1s relevante como es el cerdo. Debido a que las rhegf-nlc mostraron una ee superior a las rhegf-sln, no requieren disolventes org\u00e1nicos para su preparaci\u00f3n y ambas nanoformulaciones mostraron tener las misma eficacia in vitro e in vivo, en este cap\u00edtulo tan solo se estudi\u00f3 la efectividad de 20 \u00c2\u00bfg de rhegf-nlc en un modelo porcino de cicatrizaci\u00f3n, en comparaci\u00f3n con el nlc vac\u00edas y dos administraciones intralesionales semanales de 75 \u00c2\u00bfg de rhegf libre. Los resultados de este estudio revelaron que 20 \u00c2\u00bfg derhegf-nlc administrados por v\u00eda t\u00f3pica eran m\u00e1s eficaces reduciendo el \u00e1rea de la herida que las nlc vac\u00edas, y al menos tan eficaz como el mismo n\u00famero de la administraci\u00f3n de 75 mg de rhegf libre administrado por v\u00eda intralesional. De forma muy destacable, el examen histol\u00f3gico mostr\u00f3 que el d\u00eda 15 de estudio las lesiones tratadas con rhegf-nlc t\u00f3pico alcanzaban una mayor longitud epitelial que le resto de grupos estudiados, incluyendo el grupo tratado con rhegf libre.Por otro lado, la evaluaci\u00f3n histol\u00f3gica tambi\u00e9n demostr\u00f3 que la madurez de la herida y la calidad de la cicatrizaci\u00f3n, el grado de resoluci\u00f3n del estado inflamatorio as\u00ed c\u00f3mo el n\u00famero de nuevos vasos formados de aquellos grupos tratados con rhegf-nlc era superior que el resto de grupos. Todos estos datos son especialmente significativos porque las heridas tratadas con rhegf-nlc recibieron dos dosis semanales de 20 \u00c2\u00bfg de rhegf administrado por v\u00eda t\u00f3pica, mientras que los tratados con rhegf libre recibieron dosis m\u00e1s altas (75 \u00c2\u00bfg dos veces a la semana) administrados por v\u00eda intralesional. Estos datos demuestran que las rhegf-nlc no s\u00f3lo permiten una reducci\u00f3n significativa de la dosis de factor de crecimiento, sino tambi\u00e9n su administraci\u00f3n t\u00f3pica de una manera efectiva. Estos resultados, de acuerdo con varios autores, pueden atribuirse a la protecci\u00f3n frente a las proteasas existentes en la herida que proporciona la nanoencapsulaci\u00f3n. Cap\u00edtulo 4:en el \u00faltimo cap\u00edtulo de esta tesis doctoral se busco desarrollar un sistema de libraci\u00f3n apropiado para las rhegf-sln y las rhegf-nlc. Para ello, las nanopart\u00edculas fueron incorporadas en tres veh\u00edculos diferentes: un hidrogel mucoadhesivo que permite prologar significativamente el tiempo de permanencia de las formulaciones en la piel, llamado noveon\u00c2\u00ae, un hidrogel anfifilico que se trasforma de una soluci\u00f3n acuosa a un hidrogel semis\u00f3lido al incrementar la temperatura de 4\u00c2\u00bac a 23 \u00c2\u00bac, llamado pluronic f-127 y un soporte s\u00f3lido de fibrina que es un importante mediador hemost\u00e1tico. A continuaci\u00f3n, estos sistemas de liberaci\u00f3n integrados  fueron caracterizados para evaluar la liberaci\u00f3n de rhegf y la disposici\u00f3n de nanopart\u00edculas a trav\u00e9s de la piel intacta y parcialmente da\u00f1ada en un modelo ex vivo de piel de cerdo.En ninguno de los estudios realizados se observaron diferencias significativas entre rhegf-sln y rhegf-nlc, sea cual sea el veh\u00edculo. En todos los casos, el rhegf liberado de las nanopart\u00edculas permaneci\u00f3 principalmente en las capas m\u00e1s superficiales de la piel. Adem\u00e1s, tal y c\u00f3mo se pudo confirmar en los estudios de microscop\u00eda confocal las np marcadas permanecieron en la parte superior de la piel actuando como reservorios para proporcionar una liberaci\u00f3n sostenida de rhegf. Teniendo en cuenta que los soportes de fibrina pueden tener una mayor estabilidad a largo plazo que ambas formulaciones semis\u00f3lidas y debido a sus propiedades homeost\u00e1ticas , se podr\u00eda concluir que el soporte a base de fibrina puede ser la alternativa m\u00e1s adecuada para la formulaci\u00f3n de las nanopart\u00edculas lip\u00eddicas cargadas con rhegf. Sin embargo, antes de decidir el veh\u00edculo m\u00e1s apropiado, resulta necesario realizar estudios de estabilidad a largo plazo y estudios in vivo en animales con cicatrizaci\u00f3n impedida.De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo experimental, las principales conclusiones son: &#8211;\tuna sola administraci\u00f3n de microesferas de plga-alginato desarrolladas han demostrado ser eficaz promoviendo una cicatrizaci\u00f3n m\u00e1s r\u00e1pida y eficiente que 5 dosis de rhegf no-encapsulado en un modelo de herida por escisi\u00f3n total en ratas wistar diabetizadas.-\tLos experimentos llevados a cabo en ratones db\/db mostraron que cuatro dosis t\u00f3picas de 10 o 20 \u00c2\u00bfg de sln-rhegf o nlc-rhegf eran m\u00e1s efectivas promoviendo la cicatrizaci\u00f3n que el mismo n\u00famero de administraciones intralesionales de 75 \u00c2\u00bfg de rhegf libre, e igualmente efectivas que una \u00fanica administraci\u00f3n intralesional de 75 \u00c2\u00bfg de ms-rhegf.-\tLa radiaci\u00f3n gamma podr\u00eda ser un proceso apropiado para la esteilizaci\u00f3n terminal de las rhegf-ms y rhegf-np.-\tDe acuerdo a los estudios realizados en un modelo porcino de herida por escisi\u00f3n total, 20 \u00c2\u00bfg de rhegf-nlc administradas dos veces por semana de forma t\u00f3pica, no solo aumentara la velocidad de cierre de la herida compar\u00e1ndolo con el mismo n\u00famero de administraciones intralesionals de 75 \u00c2\u00bfg de rhegf libre, sino que tambi\u00e9n mejoraron la calidad de la cicatrizaci\u00f3n.-\tLas nanopart\u00edculas l\u00edpidicas cargadas con rhegf son sistemas de liberaci\u00f3n apropiados para el tratamiento local de heridas cr\u00f3nicas porque, independientemente del tipo de ap\u00f3sito-sistema de liberaci\u00f3n integrado que se ha preparado, se mantienen en la superficie de la piel durante al menos 48 h y act\u00faan como un reservorio para la liberaci\u00f3n sostenida del rhegf.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Microspheres and nanoparticles to release rhegf as an advanced approach for skin regeneration<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Microspheres and nanoparticles to release rhegf as an advanced approach for skin regeneration <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Garazi Gainza Luzea <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 22\/01\/2015<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Manuela Igartua Olaechea<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: carmen Mar\u00eda Evora Garc\u00eda <\/li>\n<li>bego\u00f1a Delgado charro (vocal)<\/li>\n<li>Jos\u00e9 ramon Sarasua oiz (vocal)<\/li>\n<li>marcela Del rio nechaevsky (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Garazi Gainza Luzea Las heridas cr\u00f3nicas, definidas como, aquellas heridas cuyo proceso de cicatrizaci\u00f3n se ve retrasado 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