{"id":117232,"date":"2015-06-03T00:00:00","date_gmt":"2015-06-03T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/design-and-evaluation-of-non-viral-vectors-based-on-solid-lipid-nanoparticles-for-the-treatment-of-x-linked-juvenile-retinoschisis-by-gene-therapy\/"},"modified":"2015-06-03T00:00:00","modified_gmt":"2015-06-03T00:00:00","slug":"design-and-evaluation-of-non-viral-vectors-based-on-solid-lipid-nanoparticles-for-the-treatment-of-x-linked-juvenile-retinoschisis-by-gene-therapy","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/analisis-de-farmacos\/design-and-evaluation-of-non-viral-vectors-based-on-solid-lipid-nanoparticles-for-the-treatment-of-x-linked-juvenile-retinoschisis-by-gene-therapy\/","title":{"rendered":"Design and evaluation of non-viral vectors based on solid lipid nanoparticles for the treatment of x-linked juvenile retinoschisis by gene therapy"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Paola Stephanie Apaolaza Gallegos <\/strong><\/h2>\n<p>La retinosquisis juvenil ligada al cromosoma x (xlrs) es una enfermedad degenerativa de la retina que afecta a entre 1\/5,000 y 1\/25,000 individuos en el mundo. Se debe a la mutaci\u00f3n del gen rs1, que codifica la prote\u00edna retinosquisina. La ausencia de esta prote\u00edna produce la separaci\u00f3n de las capas de la retina y la formaci\u00f3n de quistes intrarretinianos, que finalmente conducen a la ceguera de los pacientes, no existiendo actualmente tratamiento ni curativo ni preventivo para esta enfermedad. Al ser una enfermedad monog\u00e9nica recesiva, es una excelente candidata para la terapia g\u00e9nica. Hasta ahora los estudios que se han publicado sobre la aplicaci\u00f3n de terapia g\u00e9nica en el tratamiento de la xlrs han sido con vectores virales. Debido a los problemas de este tipo de vectores desde el punto de vista de la seguridad, los vectores no virales constituyen una estrategia muy prometedora.Dentro de los vectores no virales, las nanopart\u00edculas s\u00f3lidas lip\u00eddicas (slns) presentan grandes ventajas, ya que han demostrado capacidad de transfecci\u00f3n de tejidos oculares y est\u00e1n constituidas por materiales biocompatibles y biodegradables, se pueden producir a nivel industrial a menor coste que los vectores virales, y se pueden someter a procedimientos de liofilizaci\u00f3n para prolongar su estabilidad durante el almacenamiento.Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, el objetivo de esta tesis ha sido el dise\u00f1o y evaluaci\u00f3n de vectores no virales basados en nanopart\u00edculas lip\u00eddicas para el tratamiento de la xlrs mediante terapia g\u00e9nica.En un estudio previo se prepar\u00f3 un vector con slns, protamina y dextrano (dx) que fue capaz de transfectar la retina tras su administraci\u00f3n ocular a ratas. Como primer objetivo de esta tesis, se procedi\u00f3 a modificar la formulaci\u00f3n substituyendo el dx por \u00e1cido hialur\u00f3nico (ha), cuyos beneficios para terapia g\u00e9nica son conocidos. Se dise\u00f1aron varias formulaciones con ha de diferente peso molecular (150, 500 y 1500 kda) y con diferente proporci\u00f3n ha:adn. Estudios en c\u00e9lulas hek-293 y arpe-19, dos l\u00edneas celulares con diferente capacidad de divisi\u00f3n celular, mostraron la alta eficacia de transfecci\u00f3n de los vectores, no detect\u00e1ndose diferencias dependiendo del tama\u00f1o molecular del ha. Adem\u00e1s, los vectores presentaron una alta capacidad de internalizaci\u00f3n celular. Se estudiaron los mecanismos de endocitosis, comprob\u00e1ndose que en c\u00e9lulas arpe-19, los vectores son captados tanto por endocitosis mediada por clatrinas como por endocitosis mediada por caveolas; adem\u00e1s, en el proceso de internalizaci\u00f3n tambi\u00e9n interviene el receptor cd44, que explica la capacidad del ha de unirse a este receptor. En c\u00e9lulas hek-293, los vectores entran fundamentalmente por endocitosis mediada por caveolas. As\u00ed, en c\u00e9lulas arpe-19, la liberaci\u00f3n del adn a nivel intracelular, paso previo para su entrada en el n\u00facleo para poder desencadenar el proceso de transfecci\u00f3n, est\u00e1 condicionada por la actividadlisosomal derivada de la fusi\u00f3n del endosoma con los lisosomas cuando la endocitosis est\u00e1 mediada por clatrinas. Sin embargo, en c\u00e9lulas hek-293, donde los vectores entran por v\u00eda caveolas, que evita la acci\u00f3n lisosomal, la transfecci\u00f3n est\u00e1 condicionada por la capacidad de liberaci\u00f3n del adn a nivel intracelular. En este sentido, el ha es capaz de modular el alto grado de condensaci\u00f3n del adn en el vector debido a la protamina, favoreciendo su liberaci\u00f3n, y por tanto la transfecci\u00f3n. Una vez caracterizado, se comprob\u00f3 que el vector era capaz de transfectar c\u00e9lulas arpe-19 y producir la prote\u00edna terap\u00e9utica retinosquisina.Aunque se han obtenido resultados prometedores en estudios con modelos animales en los que se aplicaba terapia g\u00e9nica para el tratamiento de la xlrs, siempre se han utilizado vectores virales. Debido a la limitaci\u00f3n de este tipo de vectores, fundamentalmente desde el punto de vista de la seguridad, y a los resultados obtenidos in vitro con nuestros vectores, se procedi\u00f3 a la evaluaci\u00f3n tanto del vector preparado con ha como del vector preparado con dx en ratones normales y en ratones deficientes en el gen rs1, modelo animal de la xlrs. Los dos vectores se administraron por v\u00eda intrav\u00edtrea y por v\u00eda subretiniana.Una vez el vector elaborado con ha fue optimizado y caracterizado se procedi\u00f3 a su evaluaci\u00f3n en ratones tras su administraci\u00f3n intrav\u00edtrea y subretiniana. Para ello, se prepararon los vectores con el pl\u00e1smido que conten\u00eda el gen rs1y el gen de la prote\u00edna verde fluorescente (gfp) bajo la acci\u00f3n de un promotor inespec\u00edfico. La expresi\u00f3n de gfp, al ser una prote\u00edna intracelular, nos permite conocer en qu\u00e9 c\u00e9lulas de la retina se produce la transfecci\u00f3n, y la expresi\u00f3n de retinosquisina, al ser una prote\u00edna secretada, nos permite estudiar su localizaci\u00f3n tras el proceso de transfecci\u00f3n y secreci\u00f3n.Una semana despu\u00e9s de la administraci\u00f3n de los vectores a ratones normales por v\u00eda intrav\u00edtrea y subretiniana, se detect\u00f3 la gfp en todos los animales tratados y en casi todas la capas de la retina, incluyendo c\u00e9lulas de epitelio pigmentario y fotorreceptores. Con la administraci\u00f3n subretiniana, se transfectaron principalmente c\u00e9lulas del epitelio y fotorreceptores, aunque con la formulaci\u00f3n de ha tambi\u00e9n se obtuvo una alta expresi\u00f3n en c\u00e9lulas ganglionares. Tras la administraci\u00f3n intrav\u00edtrea, se transfectaron principalmente c\u00e9lulas ganglionares. Estos resultados indican la capacidad de los vectores de proteger y liberar el gen y hacer que se exprese en diferentes capas de la retina. Adem\u00e1s, se puso de manifiesto su capacidad para difundir desde el lugar de inyecci\u00f3n a trav\u00e9s de la retina, especialmente con el vector ha-sln.Se procedi\u00f3 a continuaci\u00f3n a administrar los vectores a ratones deficientes en el gen rs1. Dos semanas despu\u00e9s de la inyecci\u00f3n, se detect\u00f3 la retinosquisina en todas las capas de la retina, excepto en la capa onl. En general, la administraci\u00f3n subretiniana proporcion\u00f3 un mayor nivel de expresi\u00f3n que la inyecci\u00f3n intrav\u00edtrea, no encontr\u00e1ndose diferencias entre los dos vectores. Esto podr\u00eda ser debido a que la difusi\u00f3n de ambos vectores est\u00e1 favorecida por la desorganizaci\u00f3n de la retina como consecuencia del defecto gen\u00e9tico, y no tanto por la composici\u00f3n del vector. El an\u00e1lisis estructural de la retina de los ratones revel\u00f3 que en los ojos tratados hab\u00eda una menor p\u00e9rdida de fotorreceptores, una disminuci\u00f3n de quistes y una mejora de la organizaci\u00f3n de la retina con respecto a los ratones no tratados. Adem\u00e1s, se increment\u00f3 el grosor de la retina. Dos meses despu\u00e9s de la administraci\u00f3n subretiniana, se detect\u00f3 una menor expresi\u00f3n de retinosquisina que a las dos semanas, y el efecto reparador de la retina tambi\u00e9n fue menor.Ya que en un estudio previo se sugiri\u00f3 que aunque la retinosquisina se puede sintetizar en diferentes tipos de c\u00e9lulas, su actividad es mayor cuando se sintetiza en los fotorreceptores. Por ello, para incrementar laresumen3transfecci\u00f3n en fotorreceptores, se prepararon los vectores con el gen rs1 bajo el control del promotor mops, que presenta una alta actividad en estas c\u00e9lulas y se procedi\u00f3 a su evaluaci\u00f3n tras su inyecci\u00f3n intrav\u00edtrea en ratones deficientes en el gen rs1. El an\u00e1lisis de la prote\u00edna gfp demostr\u00f3 una mayor transfecci\u00f3n con el vector ha-sln en fotorreceptores que con el vector dx-sln. Sin embargo no se encontraron diferencias en los niveles de retinosquisina entre los dos vectores. Los mayores niveles de retinosquisina se detectaron en fotorreceptores, en la capa inl y en c\u00e9lulas ganglionares. Hay que tener en cuenta que esta prote\u00edna es secretada por la c\u00e9lula una vez sintetizada, por lo que su detecci\u00f3n en una determinada capa celular no significa que sea en esa capa donde se haya sintetizado. El an\u00e1lisis estructural de la retina mostr\u00f3 una mejor\u00eda en cuanto a la organizaci\u00f3n de la retina, p\u00e9rdida de fotorreceptores y presencia de quistes. Adem\u00e1s, aument\u00f3 el grosor de la retina y de la capa onl, adem\u00e1s con el vector ha-sln, se alcanzaron los niveles de los ratones sanos. El mayor efecto del vector ha-sln sobre la recuperaci\u00f3n de la retina se asocia a una mayor formaci\u00f3n de la retinosquisina en fotorreceptores con este vector.En conclusi\u00f3n, este trabajo ha demostrado en ratones deficientes en el gen rs1 la capacidad de vectores no virales basados en nanopart\u00edculas s\u00f3lidas lip\u00eddicas para restaurar la estructura de la retina. A pesar de los prometedores resultados, son necesarios estudios adicionales para comprobar el efecto a m\u00e1s largo plazo y si la recuperaci\u00f3n de la retina implica una mejor\u00eda en la funci\u00f3n visual.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Design and evaluation of non-viral vectors based on solid lipid nanoparticles for the treatment of x-linked juvenile retinoschisis by gene therapy<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Design and evaluation of non-viral vectors based on solid lipid nanoparticles for the treatment of x-linked juvenile retinoschisis by gene therapy <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Paola Stephanie Apaolaza Gallegos <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 06\/03\/2015<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>M\u00aaangeles Solinis Aspiazu<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: enrique Echevarria orella <\/li>\n<li>dolores Hernan perez de la ossa (vocal)<\/li>\n<li>Juan  Manuel Irache garreta (vocal)<\/li>\n<li>rocio Herrero vanrell (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Paola Stephanie Apaolaza Gallegos La retinosquisis juvenil ligada al cromosoma x (xlrs) es una enfermedad degenerativa de 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