{"id":117331,"date":"2018-03-11T10:46:47","date_gmt":"2018-03-11T10:46:47","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/development-of-soft-and-rigid-membrane-nanotemplates-for-the-mechanistic-analysis-of-dynamin-i-action-on-curved-surfaces\/"},"modified":"2018-03-11T10:46:47","modified_gmt":"2018-03-11T10:46:47","slug":"development-of-soft-and-rigid-membrane-nanotemplates-for-the-mechanistic-analysis-of-dynamin-i-action-on-curved-surfaces","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/lipidos\/development-of-soft-and-rigid-membrane-nanotemplates-for-the-mechanistic-analysis-of-dynamin-i-action-on-curved-surfaces\/","title":{"rendered":"Development of soft and rigid membrane nanotemplates for the mechanistic analysis of dynamin i action on curved surfaces"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Eva Rodriguez Hortelano <\/strong><\/h2>\n

En los \u00faltimos a\u00f1os se ha ido desvelando el rol activo de la curvaturade membrana en los procesos de reorganizaci\u00f3n de membranas celulares. Lamayor\u00eda de las membranas celulares presentan una cierta curvatura; dichacurvatura es moderada en los casos de org\u00e1nulos tubulares e incluso puedellegar a ser una curvatura extrema como es el caso de los poros de fisi\u00f3n yfusi\u00f3n. Experimentos in vitro en peque\u00f1as ves\u00edculas unilamelares (suvs) onanotubos lip\u00eddicos (nts) muestran la efectividad de la curvatura demembrana en la segregaci\u00f3n lip\u00eddica y formaci\u00f3n de dominios activos entransformaciones morfol\u00f3gicas.El trabajo en esta tesis ha consistido en desarrollar herramientas invitro que nos ayuden a estudiar los procesos de elevada curvatura con laadecuada resoluci\u00f3n espacial y temporal, y a su vez que nos permitanesclarecer los mecanismos de creaci\u00f3n de curvatura de membrana y losprocesos de la remodelaci\u00f3n celular. Los patrones lip\u00eddicos utilizados sepueden dividir en patrones blandos (nts lipidicos) o patrones r\u00edgidos(nanoalambres de silicio (sinws) cubiertos de membrana).Los nt blandos utilizados poseen un di\u00e1metro luminal de variasdecenas de nan\u00f3metros y pueden tener desde unas decenas de nan\u00f3metroshasta micras de longitud. Los nanotubos m\u00e1s largos obtenidos a partir deves\u00edculas gigantes (guvs), son m\u00e1s anchos pero permiten la visualizaci\u00f3nsimultanea por microscop\u00eda de fluorescencia. Los nanotubos m\u00e1s cortos sonobtenidos a partir de bicapas lip\u00eddicas negras (blms), con mayor tensi\u00f3n quelos guvs, por lo que poseen unos radios muy reducidos.La diferencia de radios de los nts son el resultado de diversospar\u00e1metros mec\u00e1nicos de la membrana que forma el tubo. Los par\u00e1metrosmec\u00e1nicos que definen la geometr\u00eda del nt son la rigidez a la flexi\u00f3n (k,definida por la composici\u00f3n lip\u00eddica) y la tensi\u00f3n lateral de la membrana (\u00c2\u00bf\u00c2\u00bf).En este trabajo la composici\u00f3n lip\u00eddica fue id\u00e9ntica tanto para los guvs comopara las blms, por lo que el radio de los nts estaba regulado tan s\u00f3lo por latensi\u00f3n lateral de la membrana origen.La determinaci\u00f3n cuantitativa de los radios de los nts se hacemediante el paso de una corriente el\u00e9ctrica por el interior del nt demembrana. El nt de membrana ofrece una resistencia al paso de la corrienteque es funci\u00f3n del \u00e1rea de la secci\u00f3n transversal del mismo, de tal forma queexiste una dependencia del radio del nt y de su longitud. Al incrementar oempeque\u00f1ecer la longitud del nt obtenemos una respuesta en la medida deconductancia reduci\u00e9ndose o agrand\u00e1ndose \u00e9sta. De esta forma se puedehallar el radio del nt.Para los nts obtenidos a partir de guvs se determin\u00f3 que el voltajeafecta la forma del nt, dejando \u00e9ste de ser cil\u00edndrico. Se determina en estetrabajo que el radio del nt sufre una desviaci\u00f3n !!\u00bb !!! ! Que depende de lalongitud total del nt. De tal forma que el gradiente de voltaje que existe enel tubo origina una variaci\u00f3n en la tensi\u00f3n lateral y esto da como resultadouna forma de \u00c2\u00bftrompeta\u00c2\u00bf en el nt.Las medidas de conductancia sobre un nt permiten calcular en tiemporeal y simult\u00e1neamente los par\u00e1metros mec\u00e1nicos de la membrana del nt.Se procede al calculo de dichos par\u00e1metros para varias composicioneslip\u00eddicas conocidas en la literatura actualcomo se puede apreciar en lo anteriormente descrito, esta t\u00e9cnicaofrece una medida directa de la geometr\u00eda del nt as\u00ed como de los par\u00e1metrosmec\u00e1nicos que la determinan y sirve como una inestimable ayuda para elestudio de la creaci\u00f3n de nuevos compartimentos de membrana promovidospor la presencia de prote\u00ednas de fisi\u00f3n.La segunda parte de esta tesis est\u00e1 dedicada al estudio del proceso defisi\u00f3n promovido por la prote\u00edna dinamina i (dyn1), siendo \u00e9sta el prototipode prote\u00edna de fisi\u00f3n. La dyn1 es una guanosina-5\u00c2\u00bf-trifosfatasa (gtpasa) decasi 900 amino \u00e1cidos y 100 kda. La dyn1 es la prote\u00edna de fisi\u00f3n m\u00e1sestudiada ya que esta \u00edntimamente envuelta en los procesos de endocitosismediados por la clatrina. Se sabe que precisamente la dyn1 es laresponsable de la fisi\u00f3n de las ves\u00edculas en estos procesos.Sobre el modus operandi de la dyn 1 in vivo se sabe que necesita laexistencia de un cuello de membrana de elevada curvatura (cuellomimetizado in vitro por un nt) para polimerizar sus mon\u00f3meros alrededor deeste, hidrolizar las mol\u00e9culas de guanosina-5\u00c2\u00bf-trifosfato (gtp) y por \u00faltimogestionar la fisi\u00f3n de la membrana. En este trabajo se hacen referencia a dosde los diferentes estados conformacionales de la dyn1, uno el estado en elque el pol\u00edmero se ha enlazado a la mol\u00e9cula de gtp y lo llamaremos de aqu\u00eden adelante estado basal y un segundo estado pre-hidr\u00f3lisis en el que ladyn 1 sigue enlazada al guanosina difosfato (gdp) y al p que se llamar\u00e1estado de transici\u00f3n. La naturaleza ef\u00edmera de \u00e9stos estados imposibilita elestudio de estas configuraciones transitorias. Para posibilitar la obtenci\u00f3n deinformaci\u00f3n debemos de parar el proceso en estos estadios. Usando unamutaci\u00f3n de la dyn1 en combinaci\u00f3n con de una fijaci\u00f3n qu\u00edmica(crosslinker), nuestros colaboradores (laboratorio de la dra. Sandra schmid,en ut southwestern, texas, eeuu) han conseguido crear una mutante delestado de transici\u00f3n de la dyn1. Ello nos permiti\u00f3 estudiar el papel que juegaesta configuraci\u00f3n de la prote\u00edna en el proceso de fisi\u00f3n de la membrana.Cuando este mutante se a\u00f1adi\u00f3 a los nt blandos, se observ\u00f3 la formaci\u00f3n deun estado de hemifisi\u00f3n de la membrana, que nunca antes se hab\u00edadetectado in vitro. Cabe destacar que la formaci\u00f3n del estado de hemifisi\u00f3nde la membrana s\u00f3lo fue posible en ausencia de gtp. La adici\u00f3n de gtppromovi\u00f3 la desestabilizaci\u00f3n del andamiaje de la dinamina, disminuyendo sucapacidad de constricci\u00f3n de la membrana. Todo ello, unido a datosobtenidos por t\u00e9cnicas complementarias permiti\u00f3 proponer un mecanismodetallado de la fisi\u00f3n de la membrana por la dinamina, donde se da granimportancia a la inserci\u00f3n coordinada de los dominios ph de la dinaminadentro de la membrana para la formaci\u00f3n del estado de hemifisi\u00f3n. La fisi\u00f3ncompleta es una consecuencia de la hidr\u00f3lisis del gtp por la prote\u00edna y deldesensamblaje del pol\u00edmero de dynamina sobre la membrana.En la \u00faltima parte de la tesis se ha estudiado la interacci\u00f3n de la dyn1con los nt r\u00edgidos formados por nanoalambres de silicona recubierdos debicapa lip\u00eddica. \u00e9stas plantillas adem\u00e1s de ser r\u00edgidas presentan la forma dehemicilindro, por lo que la dinamina no puede ensamblarse en un circulocompleto encima de ellas. Se observ\u00f3 la formaci\u00f3n de olig\u00f3meros de dyn1encima de \u00e9stos hemicilindros. Adem\u00e1s, \u00e9stos olig\u00f3meros preservan lahabilidad de hidrolizar gtp. El rol de estos oligomeros in vivo se aclarar\u00e1 enfuturos estudios.<\/p>\n

 <\/p>\n

Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abDevelopment of soft and rigid membrane nanotemplates for the mechanistic analysis of dynamin i action on curved surfaces<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
    \n
  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Development of soft and rigid membrane nanotemplates for the mechanistic analysis of dynamin i action on curved surfaces <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Eva Rodriguez Hortelano <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Pa\u00eds vasco\/euskal herriko unibertsitatea<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 26\/03\/2015<\/li>\n<\/ul>\n

     <\/p>\n

    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
      \n
    • Director de la tesis<\/strong>\n
        \n
      • Frolov<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
          \n
        • Presidente del tribunal: alicia Alonso izquierdo <\/li>\n
        • marisela Velez tirado (vocal)<\/li>\n
        • paul scott Blank — (vocal)<\/li>\n
        • Fernando Moreno herrero (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

           <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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