{"id":57096,"date":"2018-03-09T22:44:54","date_gmt":"2018-03-09T22:44:54","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudio-molecular-y-de-apoptosis-en-ovocitos-de-cabras-prepuberes-y-su-relacion-con-el-desarrollo-embrionario\/"},"modified":"2018-03-09T22:44:54","modified_gmt":"2018-03-09T22:44:54","slug":"estudio-molecular-y-de-apoptosis-en-ovocitos-de-cabras-prepuberes-y-su-relacion-con-el-desarrollo-embrionario","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/reproduccion-animal\/estudio-molecular-y-de-apoptosis-en-ovocitos-de-cabras-prepuberes-y-su-relacion-con-el-desarrollo-embrionario\/","title":{"rendered":"Estudio molecular y de apoptosis en ovocitos de cabras prepuberes y su relacion con el desarrollo embrionario"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Bego\u00f1a Anguita Bustamante <\/strong><\/h2>\n<p>En nuestro laboratorio siempre ha trabajado con la finalidad de conseguir el m\u00e1ximo n\u00famero de blastocistos posibles a partir de ovocitos recuperados de cabras prep\u00faberes sacrificadas en matadero. La poblaci\u00f3n ovocitaria recuperada de estas hembras suele ser muy variable, debido b\u00e1sicamente a factores fisiol\u00f3gicos. Por este motivo, los ovocitos deben seleccionarse cuidadosamente con el fin de utilizar en el procedimiento de producci\u00f3n in vitro de embriones solo aquellos capaces de madurar in vitro, se fecundados y mantener el desarrollo embrionario. Hasta el momento, la selecci\u00f3n realizada en nuestro laboratorio se basaba  en criterios morfol\u00f3gicos, seleccionando solo los ovocitos rodeados de varias capas compactas de c\u00e9lulas del cumulus y citoplasma homog\u00e9neo, y de gran tama\u00f1o. Sin embargo, el porcentaje de blastocistos obtenidos utilizando los ovocitos seleccionados siguiendo estos criterios ha sido bajo, y no se ha conseguido superar el 10% (izquierdo et al 1999). Esta tesis, por lo tanto, naci\u00f3 de la necesidad de encontrar marcadores que pudieran indicarnos la competencia del ovocito, de modo que podamos distinguir los ovocitos competentes para el desarrollo del resto de ovocitos que no son capaces de desarrollarse hasta el estadio de blastocistos.  los dos primeros trabajos de esta tesis, que podemos englobar dentro de un gran bloque, tiene como objetivo estudiar el papel que juegan la expresi\u00f3n de las subunidades del mpf  (maturation promoting factor), la c\u00edclina b1 y la p34cdc2, as\u00ed como su actividad kinasa, y la acumulaci\u00f3n de rna y prote\u00ednas en os ovocitos con la adquisici\u00f3n de competencia para el desarrollo. Las t\u00e9cnicas utilizadas para evaluar el estos par\u00e1metros son t\u00e9cnicas invasivas, de modo que los ovocitos analizados no pueden ser utilizados  posteriormente para continuar el desarrollo embrionario. Por lo tanto, era necesario relacionar las caracter\u00edsticas moleculares estudiadas con un par\u00e1metro nos permitiera seleccionar los ovocitos de forma visual.  en estos trabajos el par\u00e1metro no invasivo escogido fue el di\u00e1metro  ovacitario, ya que en numerosas especies se ha observado que existe una relaci\u00f3n positiva entre la capacidad del ovocito para dar lugar a un embri\u00f3n viable y el di\u00e1metro folicular (bovino: furher et al 1989; caprino: crozet et al 1995; porcino: marchal et al 2002), y \u00e9ste, a su vez, se correlaciona con el di\u00e1metro ovictario (bovino:arlotto et al 1996;caprino crozet et al 200: de smedt et al 1994). De este modo, los ovocitos de cabras prep\u00faberes  recuperados de matadero fueron divididos  en 4 grupos seg\u00fan su tama\u00f1o:<100micra m, 110-125 micra m,125-135 micra m y >135micra m (de smedt et al 1994). Estos ovocitos fueron madurados y fecundados in vitro, y los embriones resultantes fueron cultivados sin vitro para comprobar la competencia ovocitaria de cada grupo de tama\u00f1o. A su vez, se evalu\u00f3 el estadio nuclear de una muestra de ovocitos de cada grupo antes y despu\u00e9s de la miv. El estudio de expresi\u00f3n  de las subunidades del mpf se realiz\u00f3 mediante rt-pcr y western blot para la p34cdc2. Adem\u00e1s, se cuantific\u00f3 la cantidad de prote\u00ednas y de rna acumulados en ovocitos de cada grupo mediante el m\u00e9todo de lowry modificado y por espectrofotometr\u00eda, respectivamente. Los resultados mostraron que en el momento de recoger los ovocitos de los fol\u00edculos, la mayor\u00eda ya hab\u00eda reanudado la meiosis, y esta proporci\u00f3n era mayor a medida que aumentaba el di\u00e1metro ovocitario. Adem\u00e1s, los ovocitos de mayor tama\u00f1o fueron los que alcanzaron mayor porcentaje de maduraci\u00f3n nuclear tras la miv, tuvieron mayor tasa de fecundaci\u00f3n normal, de divisi\u00f3n embrionaria a las 48 h. Post-fecundaci\u00f3n y dieron lugar al mayor porcentaje de blastocistos. Nuestros resultados mostraron que los ovocitos de mayor di\u00e1metro, que eran los m\u00e1s competentes, no difer\u00edan del resto de grupos estudiados en cuanto a la expresi\u00f3n   de arn y arnm de p34cdc2, de arnm de c\u00edclina b1 y de prote\u00edna total antes y despu\u00e9s de la miv; por el contrario, si observamos mayor niveles de arn total acumulado y de arn de c\u00edclina b1 despu\u00e9s de la miv, mayor nivel de prote\u00edna p34cdc2 y de actividad del complejo mpf. Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que la competencia para el desarrollo estaba relacionada con el mpf, sugiriendo un posible papel de este complejo en la maduraci\u00f3n citoplasm\u00e1tica.  \tel tercer trabajo surgi\u00f3 a ra\u00edz de los resultados obtenidos en los primeros estudios. Nos sorprendi\u00f3 observar que la mayor\u00eda de ovocitos hubieran reanudado la meiosis en el momento de recuperarlos de los fol\u00edculos. Los ovocitos solo reanudan en el interior de los fol\u00edculos como respuesta al estimulo hormonal de la lh, previo a la ovulaci\u00f3n, o bien debido a un proceso de degeneraci\u00f3n o atresia. Nuestros estudios se realizan en hembras prep\u00faberes, todav\u00eda no maduras hormonalmente, de modo que nos planteamos la posibilidad de que los ovocitos que est\u00e1bamos recogiendo estuviesen sufriendo un proceso mas o menos avanzado de atresia, que posiblemente pudiera interferir en los resultados de desarrollo embrionario. La realizaci\u00f3n del tercer estudio se realizado en la universidad de gante, donde utilizaban t\u00e9cnicas de detecci\u00f3n de apoptosis de modo rutinario, y se usaron ovocitos bovinos debido a la imposibilidad de disponer de ovocitos caprinos. La finalidad de este trabajo fue aprender las t\u00e9cnicas de tinci\u00f3n  con annexin v y tunel mediante la realizaci\u00f3n de un estudio de apoptosis en ovocitos bovinos, c\u00e9lulas del cumulus y blastocistos seg\u00fan el di\u00e1metro ovocitario. Para ello, los ovocitos recuperados de matadero se clasificaron en tres grupos de tama\u00f1o:<110 micra m, 110-120 micra m y >120 micra m (fair et al 1995). Los ovocitos fueron madurados y fecundados in vitro y los embriones fueron cultivados durante 6 d\u00edas m\u00e1s. Una muestra de ovocitos y c\u00e9lulas del cumulus fueron usados para evaluar apoptosis antes y despu\u00e9s de la miv mediante annexin v y tunel. El resto de los ovocitos continuaron el desarrollo embrionario y los blastocistos resultantes tambi\u00e9n fueron evaluados con las mismas t\u00e9cnicas. En este estudio la  capacidad para el desarrollo embrionario se consegu\u00eda en los ovocitos >110 micra m. Los resultados obtenidos indicaron que el porcentaje de ovocitos inmaduros que mostraban signos de apoptosis disminu\u00eda en los ovocitos >110 micra m. Adem\u00e1s el porcentaje de ovocitos apopt\u00f3ticos se redujo claramente durante la maduraci\u00f3n in viro. Por el contrario, a apoptosis en las c\u00e9lulas del cumulus aumento con la maduraci\u00f3n. Por ultimo, los blastocistos obtenidos mostraron menor incidencia de apoptosis en estadio  tard\u00edo en los ovocitos de mayor di\u00e1metro evaluado mediante annexin v pero no mediante tunel. A partir de estos resultados llegamos a la conclusi\u00f3n que las diferencias de desarrollo embrionario observadas entre ovocitos de diferente tama\u00f1o no podr\u00edan ser explicados \u00fanicamente por una diferencia en la incidencia de apoptosis entre di\u00e1metros.  \tpor ultimo, el cuarto y quinto trabajo pretend\u00eda evaluar la apoptosis en ovocitos caprinos de diferentes di\u00e1metro mediante las dos t\u00e9cnicas utilizadas en el estudio anterior. En estos trabajos quisimos introducir un par\u00e1metro mas a tener en cuenta, adem\u00e1s del di\u00e1metro ovocitario, y por ello clasificamos nuestros ovocitos tambi\u00e9n seg\u00fan criterios morfol\u00f3gicos en dos grupo: los que no mostraban signos de atresia, es decir, que presentaban el cumulus y compacto y el citoplasma homog\u00e9neo; y aquellos que presentaban signos de atresia temprana, es decir, con el cumulus ligeramente expandido y\/o citoplasma del ovocito heterog\u00e9neo. Pensamos que era interesante introducir el par\u00e1metro de la morfolog\u00eda porque nos pod\u00eda aportar mas informaci\u00f3n sobre el efecto de la apoptosis en el desarrollo embrionario. Para ello, los ovocitos fueron clasificados por di\u00e1metro siguiendo los criterios explicados en el primer trabajo, y por morfolog\u00eda seg\u00fan los par\u00e1metros anteriormente mencionados. Al igual que en el anterior estudio, la apoptosis  fue evaluada en ovocitos y c\u00e9lulas del cumulus antes y despu\u00e9s de la maduraci\u00f3n, y en los blastocistos obtenidos. En estos estudios, al igual que el realizado en bovino, tambi\u00e9n observamos una disminuci\u00f3n de la apoptosis en ovocitos y un incremento de c\u00e9lulas del cumulus durante la maduraci\u00f3n in vitro. En general, se observo que los ovocitos de mayor di\u00e1metro y de morfolog\u00eda san presentaban menos incidencia de apoptosis, aunque los resultados obtenidos difieran seg\u00fan la t\u00e9cnica utilizada. No se detectaron diferencias en los blastocistos obtenidos a partir de ovocitos de diferente di\u00e1metro. Por ultimo, pudimos observar que la capacidad para el desarrollo embrionario son depend\u00eda solo del di\u00e1metro del ovocito, sino tambi\u00e9n de su morfolog\u00eda. Por lo tanto pudimos concluir que la apoptosis si puede influenciar la capacidad para el desarrollo del ovocito, pero no la calidad del blastocisto obtenido.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudio molecular y de apoptosis en ovocitos de cabras prepuberes y su relacion con el desarrollo embrionario<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudio molecular y de apoptosis en ovocitos de cabras prepuberes y su relacion con el desarrollo embrionario <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Bego\u00f1a Anguita Bustamante <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Aut\u00f3noma de barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 16\/02\/2007<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Mar\u00eda  Teresa Paramio Nieto<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: josep Santalo <\/li>\n<li>dimitrios Rizos (vocal)<\/li>\n<li>patrick Lonergan (vocal)<\/li>\n<li>olga Francino (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Bego\u00f1a Anguita Bustamante En nuestro laboratorio siempre ha trabajado con la finalidad de conseguir el m\u00e1ximo n\u00famero 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