{"id":60446,"date":"2018-03-09T22:48:18","date_gmt":"2018-03-09T22:48:18","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/evolucion-molecular-dirigida-de-lacasas-fungicas-en-saccharomyces-cerevisiae-tolerancia-a-disolventes-organicos-y-estudios-semi-racionales\/"},"modified":"2018-03-09T22:48:18","modified_gmt":"2018-03-09T22:48:18","slug":"evolucion-molecular-dirigida-de-lacasas-fungicas-en-saccharomyces-cerevisiae-tolerancia-a-disolventes-organicos-y-estudios-semi-racionales","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/tecnologia-bioquimica\/evolucion-molecular-dirigida-de-lacasas-fungicas-en-saccharomyces-cerevisiae-tolerancia-a-disolventes-organicos-y-estudios-semi-racionales\/","title":{"rendered":"Evolucion molecular dirigida de lacasas fungicas en saccharomyces cerevisiae: tolerancia a disolventes organicos y estudios semi-racionales."},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Miren Zumarraga Uribesalgo <\/strong><\/h2>\n<p>Actualmente, la evoluci\u00f3n molecular dirigida se presenta como la estrategia m\u00e1s adecuada para la ingenier\u00eda de enzimas en ausencia de suficiente informaci\u00f3n estructural. Se trata de una efectiva herramienta que est\u00e1 revolucionando la biotecnolog\u00eda, permitiendo la mejora de propiedades enzim\u00e1ticas y el dise\u00f1o de nuevas funciones nunca antes requeridas en ambientes naturales. Esta metodolog\u00eda recrea en el laboratorio los procesos claves de la evoluci\u00f3n natural(mutaci\u00f3n, recombinaci\u00f3n y selecci\u00f3n) de manera que es posible dise\u00f1ar enzimas de gran inter\u00e9s cient\u00edfico y tecnol\u00f3gico comprimiendo la escala temporal de la evoluci\u00f3n natural desde millones de a\u00f1os a tan s\u00f3lo meses o incluso semanas. En la evoluci\u00f3n artificial o dirigida, es el investigador quien escoge la presi\u00f3n selectiva a la que va a ser sometida la prote\u00edna (ej. Altas temperaturas, presencia de disolventes, nuevas actividades o especificidades, resistencia a phs extremos, etc) lo que permite delimitar rutas evolutivas muy concretas. Para ser exactos, los cient\u00edficos emulan la variedad mediante mutaciones inducidas y\/o recombinaciones en el material gen\u00e9tico que codifica para determinadas prote\u00ednas. A continuaci\u00f3n se escogen los mejores clones de la generaci\u00f3n creada, y se utilizan como parentales en un siguiente ciclo de evoluci\u00f3n repitiendo el proceso varias veces para potencias exponencialmente la propiedad que se quiera mejorar. las lacasas (ec 1.10.3.2, bencenodiol; ox\u00edgeno oxidorreductasas) son metaloenzimas que catalizan la oxidaci\u00f3n de una gran variedad de sustratos fen\u00f3licos (orto y para difenoles, polifenoles, fenoles sustituidos); aminas arom\u00e1ticas e incluso algunos elementos y complejos inorg\u00e1nicos (mn2+,12. Fe(edta)2-), acopiada a la reducci\u00f3n del ox\u00edgeno molecular a agua. Entre otras aplicaciones  biotecnol\u00f3gicas, las lacasas se emplean en la biorremediaci\u00f3n de diversos compuestos t\u00f3xicos, el procesado de la lignocelulosa en la industria papelera o en s\u00edntesis qu\u00edmica. La mayor\u00eda de estas biotransformaciones se deben llevar a cabo en elevadas concentraciones de disolventes org\u00e1nicos, lo cual puede disminuir la estabilidad de la enzima provocando su desnaturalizaci\u00f3n e inactivaci\u00f3n. en la presente tesis doctoral se ha evolucionado la lacasa termoestable del ascomicete myceliophthora thermophila hacia su actividad y estabilidad en presencia de disolventes org\u00e1nicos. El producto gen\u00e9tico de cinco ciclos de evoluci\u00f3n dirigida expresado en saccharomyces cerevisiae, la lacasa r2, toler\u00f3 concentraciones superiores al 50% (v\/v) de un amplio n\u00famero cosolventes miscibles en agua de relevancia biotecnol\u00f3gica. Las caracter\u00edsticas intr\u00ednsecas electroqu\u00edmicas de la lacasa como el potencial redox de los sitios t1 y t2\/t3 y la estructura geom\u00e9trica y electr\u00f3nica de los cobres catal\u00edticos se vieron alteradas en el transcurso de los experimentos de evoluci\u00f3n in vitro. Algunas de las mutaciones se localizaron en la superficie de la proteina estableciendo nuevos puentes de hidr\u00f3geno y pares salinos que contribuyeron a una mayor estabilidad de la estructura proteica en diferentes regiones propensas a la desnaturalizaci\u00f3n. Adem\u00e1s, las mutaciones introducidas en la extensi\u00f3n c-terminal afectaron al plegamiento de la prote\u00edna en los estadios de maduraci\u00f3n post-traduccionales. por otra parte, se ha desarrollado una nueva metodolog\u00eda llamada in vivo overlap extensi\u00f3n (ivoe, extensi\u00f3n por solapamiento in vivo) que se basa en la elevada frecuencia de recombinaci\u00f3n hom\u00f3loga de saccharomyces cerevisiae. Esta herramienta proporciona una alternativa in vivo, r\u00e1pida y eficaz para la construcci\u00f3n de librer\u00edas de mutagenesis saturada combinatorial evitando reacciones de pcr adicionales, formaci\u00f3n de sub-productos y los pasos de ligaci\u00f3n in vitro. Mediante la t\u00e9cnica de mutagenesis saturada, donde un \u00fanico cod\u00f3n que codifica para un determinado amino\u00e1cido de inter\u00e9s es mutado por todos los codones que codifican los 20 amino\u00e1cidos naturales, se logra expandir el n\u00famero de sustituciones aminoac\u00eddicas accesibles por mutagenesis aleatoria. Adem\u00e1s, tambi\u00e9n puede utilizarse par mutagenizar simult\u00e1neamente varios codones (mutagenesis saturada combinatorial) tanto en bloques contiguos como en posiciones separadas. De esta forma se exploran todas las posibles combinaciones y permutaciones de amino\u00e1cidos de inter\u00e9s para identificar sus \u00f3ptimas interacciones y sinergias en el estudio las propiedades proteicas deseadas. En este trabajo se han realizado diferentes experimentos de mutagenesis saturada combinatorial mediante ivoe sobre residuos clave de la lacasa, aparentemente implicados en la modulaci\u00f3n del potencial redox de la enzima. Tras explorar m\u00e1s de 170000 ciones, la mejor variante del estudio, la lacasa 7e1, revel\u00f3 una relaci\u00f3n directa entre el trip\u00e9ptido altamente conservado 509vsg511, localizado en la proximidad del sitio t1, y la tapa c-terminal.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Evolucion molecular dirigida de lacasas fungicas en saccharomyces cerevisiae: tolerancia a disolventes organicos y estudios semi-racionales.<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Evolucion molecular dirigida de lacasas fungicas en saccharomyces cerevisiae: tolerancia a disolventes organicos y estudios semi-racionales. <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Miren Zumarraga Uribesalgo <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Aut\u00f3noma de Madrid<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 14\/09\/2007<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Miguel Alcalde Galeote<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: margarita Salas falgueras <\/li>\n<li>julio Polaina molina (vocal)<\/li>\n<li>mario Mencia caballero (vocal)<\/li>\n<li>Mar\u00eda Fernandez lobato (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Miren Zumarraga Uribesalgo Actualmente, la evoluci\u00f3n molecular dirigida se presenta como la estrategia m\u00e1s adecuada para la 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