{"id":64076,"date":"2018-03-09T22:52:04","date_gmt":"2018-03-09T22:52:04","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/desarrollo-de-un-metodo-para-la-deteccion-simultanea-de-las-mutaciones-mas-frecuentes-de-la-beta-talasemia-en-espana\/"},"modified":"2018-03-09T22:52:04","modified_gmt":"2018-03-09T22:52:04","slug":"desarrollo-de-un-metodo-para-la-deteccion-simultanea-de-las-mutaciones-mas-frecuentes-de-la-beta-talasemia-en-espana","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/bioquimica\/desarrollo-de-un-metodo-para-la-deteccion-simultanea-de-las-mutaciones-mas-frecuentes-de-la-beta-talasemia-en-espana\/","title":{"rendered":"Desarrollo de un metodo para la deteccion simult\u00e1nea de las mutaciones mas frecuentes de la beta-talasemia en espa\u00f1a"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Tomas De Haro Mu\u00f1oz <\/strong><\/h2>\n<p>El aumento de hemoglobinopat\u00edas acontecido en los \u00faltimos a\u00f1os en nuestro pa\u00eds por los movimientos migratorios ha determinado la necesidad de ampliar los conocimientos cl\u00ednicos, epidemiol\u00f3gicos y de diagn\u00f3stico que nos permitan afrontar mejor este problema de salud emergente.  la microcitosis es el dato de labora torio cl\u00e1sico para la detecci\u00f3n de talasemias y es el que se ha empleado durante a\u00f1os para la detecci\u00f3n de portadores, mostrando una buena sensibilidad. Su confirmaci\u00f3n mediante el incremento de la hb a2 permite realizar el diagn\u00f3stico de beta-talasemia. Sin embargo, estos estudios nunca pueden ser realizados en e 1 reci\u00e9n nacido dado que presenta cifras bajas o indetectables de hb a2, e incluso en los pacientes homocigotos para la beta-talasemia, el diagn\u00f3stico no puede establecerse con seguridad hasta 3-6 meses tras el nacimiento. La \u00fanica manera de poderlos diagnosticar con seguridad es mediante el an\u00e1lisis directo del gen con t\u00e9cnicas de biolog\u00eda molecular.  este trabajo describe un m\u00e9todo que permite la detecci\u00f3n simult\u00e1nea de una manera simple, r\u00e1pida y con una alta discriminaci\u00f3n de las mutaciones responsables de la b-talasemia usando la electroforesis capilar junto con la detecci\u00f3n fluorescente.  el m\u00e9todo se basa en la reacci\u00f3n de extensi\u00f3n de una \u00fanica base para la determinaci\u00f3n simult\u00e1nea (multiplex) de las mutaciones m\u00e1s comunes asociadas con la b-talasemia: iv si-l, ivsi-6, ivsi-ll0, cds\/9, cd6, cd37, cd39, ivsii-l y la hb s.  el objetivo del presente trabajo se centra en la puesta a punto de un m\u00e9todo de diagn\u00f3stico de las mutaciones responsables de la b-talasemia que permitan realizar un an\u00e1lisis gen\u00e9tico tanto de pacientes b-talas\u00e9micos como en personas de riesgo, o en la poblaci\u00f3n general con el objeto de poder usarse como una medida preventiva de esta enfermedad.  por ello, nos planteamos el siguiente objetivo:  desarrollo y puesta a punto de un m\u00e9todo nuevo basado en la reacci\u00f3n de extensi\u00f3n de una \u00fanica base para la determinaci\u00f3n simult\u00e1nea (m\u00faltiplex) de una manera si ple, r\u00e1pida y con una alta discriminaci\u00f3n de las mutaciones m\u00e1s comunes en espa\u00f1a asociadas a la beta-talasemia (ivsi-1, ivsi-6, ivsi-110, cd8\/9 , cd6, cd37, cd39, ivsii-1) y la hb s usando la electroforesis capilar junto con la detecci\u00f3n fluorescente, para el diagn\u00f3stico molecular tanto de pacientes beta-talas\u00e9micos como de personas de riesgo o en la poblaci\u00f3n general con objeto de poder usarse como una medida preventiva de esta enfermedad.   para lo cual hemos seguido el siguiente esquema metodol\u00f3gico: a) dise\u00f1o de oligonucle\u00f3tidos espec\u00edficos y an\u00e1lisis de las mutaciones relacionadas con la b-talasemia, mediante la incorporaci\u00f3n espec\u00edfica por pcr en el punto exacto de la mutaci\u00f3n de ddntps. b) an\u00e1lisis de los productos amplificados mediante electroforesis capilar y detecci\u00f3n fluorescente. para llevar a cabo este trabajo se han analizado 125 muestras de sangre de pacientes derivados al servicio de an\u00e1lisis cl\u00ednicos del hospital universitario \u00absan cecilio\u00bb con sospecha de -talasemia, basada en la presencia de al menos uno de los siguientes criterios: vcm < 81 fl y hba2 > 3.8 %la ele va da especificidad de la incorporaci\u00f3n de un solo ddntp, catalizado por una dna polimerasa, junto con la electroforesis capilar y detecci\u00f3n fluorescente hace que la reacci\u00f3n snapshot sea un m\u00e9todo adecuado para la determinaci\u00f3n de los polimorfismos de un solo nucle\u00f3tido responsables de la -talasemia.   las condiciones ideales para la detecci\u00f3n de las mutaciones responsables de la -talasemia desarrollada en este trabajo han sido las siguientes:  a)\treacci\u00f3n de amplificaci\u00f3n del amplic\u00f3n: concentraci\u00f3n de dna 50 ng, , una concentraci\u00f3n de cebadores de 0,2 m, 200 ?M dntps, 1,5 mm de c12mg, 1 u taq gold dna polymerase (app lied biosystems), ix buffer pcr 11 (contiene 10 mm tris-hcl ph 8.3 y 50 mm kc1), en un volumen final de reacci\u00f3n de 25?1. El programa de amplificaci\u00f3n fue el siguiente: desnaturalizaci\u00f3n inicial de 10 min a 95 \u00c2\u00ba c, 30 ciclos a 95\u00c2\u00ba durante 30 s, con una temperatura de 55\u00c2\u00ba durante 30 s y a 72 \u00c2\u00ba c durante 2 mini y una extensi\u00f3n final a 72 \u00c2\u00ba c durante 7 min.  b) reacci\u00f3n de extensi\u00f3n de un \u00fanico nucle\u00f3tido: la reacci\u00f3n de snapshot conten\u00eda, en un volumen f inal de 10 l: 5 l de \u00absnapshot multiplex ready reaction mix\u00bb,  3 l del producto de amplificaci\u00f3n y una concentraci\u00f3n final d e 0,2 m de cebadores. El programa de amplificaci\u00f3n fue el siguiente: 10 min a 96 \u00c2\u00ba c, seguido de 30 ciclos a 95\u00c2\u00b0c durante 15 s , 59 \u00c2\u00ba c durante 1 min.  la aplicaci\u00f3n de este m\u00e9todo ha permitido identificar el 73 % de los alelos responsables de la -talasemia que se agrupan en cinco mutaciones diferentes (iv8i-1, iv 81-6, iv8i-110, cd8\/9 y cd39).   la frecuencia al\u00e9lica de las mutaciones detectadas ha sido la siguiente: 44.8% para la mutaci\u00f3n cd39 seguida en frecuencia por la mutaci\u00f3n iv8i-110 con 19, 2%, iv8i-1 con 16.6%, la cd8\/9 con un 12.8% y la iv8i-6 con un 5.1%.  de los 125 casos estudiados se ha detectado un individuo con hb s en heterocigosis.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Desarrollo de un metodo para la deteccion simult\u00e1nea de las mutaciones mas frecuentes de la beta-talasemia en espa\u00f1a<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Desarrollo de un metodo para la deteccion simult\u00e1nea de las mutaciones mas frecuentes de la beta-talasemia en espa\u00f1a <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Tomas De Haro Mu\u00f1oz <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Granada<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 18\/04\/2008<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Jos\u00e9 Antonio Gomez Capilla<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: manuel Garcia morillas <\/li>\n<li>ricardo Sola garcia (vocal)<\/li>\n<li>estrella Ruiz requena (vocal)<\/li>\n<li>Antonio  Miguel Poyatos andujar (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Tomas De Haro Mu\u00f1oz El aumento de hemoglobinopat\u00edas acontecido en los \u00faltimos a\u00f1os en nuestro pa\u00eds por 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