{"id":65579,"date":"2018-03-09T22:53:41","date_gmt":"2018-03-09T22:53:41","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/cultivos-transgenicos-de-bacillus-thuringiensis-aparicion-de-resistencia-en-insectos-plaga-y-efecto-sobre-fauna-auxiliar\/"},"modified":"2018-03-09T22:53:41","modified_gmt":"2018-03-09T22:53:41","slug":"cultivos-transgenicos-de-bacillus-thuringiensis-aparicion-de-resistencia-en-insectos-plaga-y-efecto-sobre-fauna-auxiliar","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/ciencias-de-la-vida\/cultivos-transgenicos-de-bacillus-thuringiensis-aparicion-de-resistencia-en-insectos-plaga-y-efecto-sobre-fauna-auxiliar\/","title":{"rendered":"Cultivos transg\u00e9nicos de bacillus thuringiensis: aparici\u00f3n de resistencia en insectos plaga y efecto sobre fauna auxiliar"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Ana Rodrigo Sim\u00f3n <\/strong><\/h2>\n<p>En esta tesis se ha estudiado la naturaleza de la resistencia a las prote\u00ednas cry en distintas colonias de insectos plaga de invernadero y de laboratorio. El objetivo principal es entender los mecanismos subyacentes a la resistencia. Esto es de gran importancia para poder desarrollar nuevas estrategias que retrasen la aparici\u00f3n de resistencia en campo o implementar las ya existentes. se ha tratado del mismo modo de desarrollar nuevas t\u00e9cnicas (inmunodetecci\u00f3n in vivo, preservaci\u00f3n de receptores por liofilizaci\u00f3n) y poner a punto en nuestro laboratorio otras t\u00e9cnicas ya existentes (formaci\u00f3n de poro) aplicadas al estudio del mecanismo de acci\u00f3n de las prote\u00ednas cry de b. Thuringiensis. El conocimiento del mecanismo de acci\u00f3n de estas prote\u00ednas es requisito indispensable para estudiar su toxicidad en organismos beneficiosos as\u00ed como para establecer las causas de la resistencia en insectos plaga. finalmente, se ha abordado de forma rigurosa el estudio del posible efecto negativo de los cultivos-bt en chrysoperla carnea. Este es un tema controvertido que diversos grupos han estudiado desde los a\u00f1os 90 y que, con nuestra aproximaci\u00f3n multidisciplinar, ha quedado definitivamente cerrado. a continuaci\u00f3n se resumen \u00fanicamente los experimentos y resultados obtenidos en esta tesis, sin embargo hay que tener en cuenta que forman parte de estudios en colaboraci\u00f3n con otros grupos y que en las publicaciones adjuntas se proporcionan m\u00e1s datos que enriquecen la discusi\u00f3n y podr\u00edan favorecer comprensi\u00f3n de los resultados presentados a continuaci\u00f3n. i.- Desarrollo de un nuevo m\u00e9todo de preservaci\u00f3n de receptores de las prote\u00ednas cry la alteraci\u00f3n de la uni\u00f3n de las prote\u00ednas cry a receptores espec\u00edficos en el intestino de los insectos es el mecanismo de resistencia m\u00e1s com\u00fan y mejor caracterizado. Por tanto, el conocimiento de las interacciones prote\u00edna-receptor es de crucial importancia para el dise\u00f1o apropiado de estrategias de prevenci\u00f3n de resistencia cruzada. El procedimiento habitual para estos estudios es la preparaci\u00f3n de bbmv (ves\u00edculas de membrana intestinal de borde en cepillo) de intestinos de larvas frescas o congeladas. el env\u00edo de insectos plaga vivos entre laboratorios en el mundo supone un gran riesgo medioambiental por lo que durante mucho tiempo la forma habitual de transporte ha sido en hielo seco conllevando restricciones aduaneras y frecuentes perdidas de material, en ocasiones irreemplazable. Por este motivo nos planteamos como objetivo el desarrollo de un nuevo m\u00e9todo de preservaci\u00f3n de receptores de las prote\u00ednas cry. los resultados mostraron que los receptores de la membrana epitelial de borde en cepillo del intestino de los insectos analizados (manduca sexta, spodoptera exigua y helicoverpa armigera) mantienen su capacidad de uni\u00f3n a cry1ab despu\u00e9s de haber sido liofilizados y transportados en hielo. las muestras liofilizadas mostraron adem\u00e1s un mayor rendimiento (mg bbmv\/g intestino) respecto a sus correspondientes congeladas. Mientras que las bbmv obtenidas a partir de material liofilizado mostraron par\u00e1metros de uni\u00f3n y actividad enzim\u00e1tica de marcadores de membrana con valores semejantes a los de los controles congelados. posteriores experimentos no incluidos en esta tesis han ampliado los resultados de este estudio demostrando que es posible realizar experimentos de uni\u00f3n in vitro de otras prote\u00ednas cry1 a bbmv procedentes de intestinos liofilizados o de larvas completas liofilizadas que fueron, en ambos casos, transportados a temperatura ambiente. ii.- Caracterizaci\u00f3n los mecanismos de resistencia a las prote\u00ednas cry en colonias de insectos plaga. el objetivo de estos estudios fue caracterizar la resistencia en diversas colonias de insectos. Resultaba de gran inter\u00e9s poder comparar distintas especies de insectos plaga que a su vez hab\u00edan sido seleccionados para la resistencia de las prote\u00ednas cry mediante diferentes m\u00e9todos. los insectos fueron proporcionados por los grupos colaboradores y en el caso de o. Nubilalis, los intestinos fueron transportados a temperatura ambiente tras ser liofilizados. Posteriormente, las muestras fueron analizadas en nuestro laboratorio. las colonias de insectos plaga resistentes a las prote\u00ednas cry que han sido analizadas en esta tesis incluyen: trichoplusia ni; plaga generalista de cultivos de invernadero. Segunda especie que ha desarrollado resistencia de forma natural, es decir, fuera de laboratorio. el resultado de los experimentos de uni\u00f3n in vitro de las prote\u00ednas cry1 ac y cry1ab a bbmv de intestinos de estos insectos confirm\u00f3 que la resistencia a cry1ac en glen-cry1ac-bcs es debida a la reducci\u00f3n de la uni\u00f3n de esta prote\u00edna a los receptores del intestino. Estudios previos hab\u00edan establecido un sitio de uni\u00f3n de alta afinidad com\u00fan para cry1ac y cry1ab en t. Ni susceptible. A este sitio de uni\u00f3n tambi\u00e9n se supone la uni\u00f3n de baja afinidad de otras prote\u00ednas como cry1aa y cry1f (estada y ferr\u00e9., 1994; iracheta et al., 2000). Nuestros resultados nos llevan a proponer como mecanismo responsable de la resistencia la alteraci\u00f3n de este sitio de uni\u00f3n com\u00fan de alta afinidad anteriormente descrito. las larvas f1  procedentes del cruzamiento entre insectos resistentes y sensibles fueron tambi\u00e9n analizadas. Tal y como cab\u00eda esperar, estos insectos mostraron susceptibilidad a cry1 ac y se mantuvo en ellos la uni\u00f3n de esta toxina en el epitelio intestinal. Por tanto se demuestra que la herencia de la resistencia es tambi\u00e9n recesiva a nivel bioqu\u00edmico y apoya los resultados fenot\u00edpicos obtenidos por janmaat et al. (2003). Los receptores propuestos para las prote\u00ednas cry1a incluyen aminopeptidasa-n (apn), cadherina, fosfatasa alcalina (m-alp) y glicol\u00edpidos. En nuestro estudio se establece la alteraci\u00f3n de la uni\u00f3n de cryl1c\/cryab como principal mecanismo de resistencia, sin embargo ser\u00e1 necesario seguir investigando sobre la naturaleza del receptor responsable de la resistencia en este insecto. Ostrinia nubilalis; plaga del ma\u00edz. Colonia resistente de laboratorio. nuestros resultados en la colonia sky de o. Nubilalis muestran una ligera variaci\u00f3n en par\u00e1metros de uni\u00f3n. La concentraci\u00f3n de receptores para cry1ab y cry1aa se mantuvo invariable entre insectos susceptibles y resistentes. Por otro lado, la afinidad de la prote\u00edna cry1aa se vio reducida 5.6 veces en insectos resistentes, sin verse afectado este par\u00e1metro en el resto de prote\u00ednas analizadas. la variaci\u00f3n observada a nivel de afinidad y concentraci\u00f3n de receptores en cry1ac no se considera significativa ya que es debida a la variabilidad en el c\u00e1lculo de la actividad espec\u00edfica de la prote\u00edna cry1ac marcada radiactivamente. la resistencia en esta colonia de o. Nubilalis ha sido asociada a la cadherina como receptor responsable mediante experimentos de ligand blot (siquiera et al., Comunicaci\u00f3n personal). en cualquier caso, el mecanismo de resistencia parece ser un proceso complejo en el que est\u00e1n implicadas mol\u00e9culas de diferente naturaleza. Por este motivo nos planteamos la necesidad de diseccionar el mecanismo de acci\u00f3n de las prote\u00ednas cry lo m\u00e1s detalladamente posible ya que cada paso de este mecanismo es una potencial diana para la resistencia. Hemos observado que en estos casos, nuestros experimentos de uni\u00f3n in vitro no resultan una herramienta suficientemente precisa para cuantificar las alteraciones de la uni\u00f3n de las prote\u00ednas cry. El motivo de esta falta de precisi\u00f3n podr\u00eda ser que la cadherina constituye una baja proporci\u00f3n de las mol\u00e9culas a las que se unen las prote\u00ednas in vitro. Podr\u00edamos decir que la uni\u00f3n \u00abefectiva\u00bb se ve enmascarada por otro tipo de uniones \u00abcontaminantes\u00bb. Otra posibilidad es que se trate de una alteraci\u00f3n del mecanismo de acci\u00f3n posterior a la uni\u00f3n. En este caso el proceso de formaci\u00f3n de poro se ver\u00eda alterado sin haber diferencias aparentes en la uni\u00f3n de las prote\u00ednas. Para estudiar esta posibilidad se puso a punto el m\u00e9todo de formaci\u00f3n de poro (bloque iii) helicoverpa zea; plaga del algod\u00f3n.  Dos colonias resistentes de laboratorio denominadas mr y ar. los resultados obtenidos en h. Zea indican que en este insecto hay un mecanismo subyacente de resistencia diferente a los descritos para otros insectos plaga en esta tesis. Este mecanismo no conlleva la p\u00e9rdida o reducci\u00f3n de la uni\u00f3n a un receptor, como fue el caso de t. Ni (bloque ii, apartado 4) ni tampoco el descenso de afinidad para las prote\u00ednas cry1a como se encontr\u00f3 en o. Nubilalis. (Bloque ii, apartado 5). Se trata pues de un mecanismo en el que aparentemente la uni\u00f3n de las prote\u00ednas cry a los receptores intestinales no se ve afectada. Alternativamente a la uni\u00f3n, podr\u00eda ser responsable de la resistencia una alteraci\u00f3n en alguno de los pasos del mecanismo post-uni\u00f3n. Por este motivo se decidi\u00f3 poner a punto el m\u00e9todo de formaci\u00f3n de poro en el laboratorio. Se plante\u00f3 la necesidad de analizar si la alteraci\u00f3n de este mecanismo era responsable de la resistencia en la colonia resistente de h. Zea (ar). el hecho de que en h. Zea la uni\u00f3n in vitro de las prote\u00ednas cry a bbmv no est\u00e9 en concordancia con la resistencia mostrada por el insecto, nos ha llevado a plantear la posibilidad de que en este caso, la uni\u00f3n reflejada en nuestros experimentos sea una mezcla de uni\u00f3n f\u00fatil y de uni\u00f3n efectiva. Por un lado, la uni\u00f3n f\u00fatil puede enmascarar aquella alteraci\u00f3n de la uni\u00f3n que refleja la resistencia cuando el n\u00famero de receptores efectivos implicados en este proceso es proporcionalmente menor. por \u00faltimo, hay que recordar que o. Nubilalis y h. Zea son colonias de insectos seleccionadas en laboratorio. Las condiciones de selecci\u00f3n, por tanto, no son las existentes en campo y podr\u00eda ocurrir que den lugar a mecanismos de resistencia que no aparecen en condiciones naturales. Debido a la falta de insectos resistentes de campo, el an\u00e1lisis de colonias resistentes de laboratorio resulta la herramienta m\u00e1s \u00fatil, pero debemos tener en cuenta sus limitaciones. Por otro lado, la t\u00e9cnica de la uni\u00f3n in vitro ha resultado de gran utilidad para caracterizar la resistencia de los dos lepid\u00f3pteros p. Xylostella y t. Ni (bloque ii, apartado i) que han desarrollado resistencia en campo e invernadero, respectivamente. Iii.- An\u00e1lisis del mecanismo de uni\u00f3n y formaci\u00f3n de poro de la prote\u00edna cry1ac en distintas partes del intestino de larvas de los lepid\u00f3pteros manduca sexta y helicoverpa armigera. el objetivo principal de este estudio fue poner a punto la t\u00e9cnica en el laboratorio para poder aplicarla con posterioridad a la caracterizaci\u00f3n de la resistencia en aquellos casos en los cuales los experimentos de uni\u00f3n in vitro no proporcionaban suficiente informaci\u00f3n. Se plante\u00f3 como primera aproximaci\u00f3n, un estudio comparativo de la uni\u00f3n in vitro y de la formaci\u00f3n de poro inducida por la prote\u00edna cry1ac en las distintas zonas del intestino medio de insectos susceptibles. el primer objetivo de este trabajo fue analizar en paralelo la uni\u00f3n de la prote\u00edna cry1ac as\u00ed como su capacidad de formar poro en la zona inicial y final del intestino medio de h. Armigera y m. Sexta. Con el fraccionamiento del intestino se pretend\u00eda enriquecer la muestra en el receptor de cry1ac (localizado principalmente en la zona final). al mismo tiempo, como segundo objetivo, se trataba de establecer un sistema que permitiera discriminar la posible uni\u00f3n f\u00fatil de cry1ac de la uni\u00f3n efectiva en insectos susceptibles. La comparaci\u00f3n de los m\u00e9todos de uni\u00f3n in vitro y de formaci\u00f3n de poro deb\u00eda darnos una idea sobre cu\u00e1l de ellos es el m\u00e1s apropiado para el estudio del mecanismo de resistencia de h. Zea. el tercer y \u00faltimo objetivo consist\u00eda en determinar si la toxicidad de cry1ac en insectos susceptibles depende de la uni\u00f3n a apn o m-alp a trav\u00e9s del residuo de galnac o si por el contrario, se trata de una uni\u00f3n f\u00fatil. Se trat\u00f3 de establecer si existen m\u00e1s receptores o ep\u00edtopos del mismo receptor, mediante los cuales la prote\u00edna cry1ac es capaz de ejercer su toxicidad provocando la formaci\u00f3n de poro en las membranas. como resultado mostrado de los experimentos realizados, se observ\u00f3 que cry1ac tiene capacidad de formar poro tanto en la zona inicial como en la zona final del intestino medio de h. Armigera y de m. Sexta. Se observ\u00f3 adem\u00e1s una mayor formaci\u00f3n de poro inducida por cry1ac en la zona final respecto a la zona inicial del intestino de ambos insectos. no se encontraron diferencias significativas en los par\u00e1metros de uni\u00f3n in vitro de cry1ac cuando fueron analizados separadamente en ambas zonas del intestino medio de h. Armigera y de m. Sexta. estos resultados confirman la hip\u00f3tesis de que en los ensayos de uni\u00f3n in vitro existe una parte de uni\u00f3n que no resulta efectiva a nivel de formaci\u00f3n de poros. Sin embargo, no se puede descartar que estas uniones no sean importantes a nivel de otros mecanismos como cascadas de se\u00f1alizaci\u00f3n intracelular relacionadas con el mecanismo de toxicidad. Se demuestra que la cuantificaci\u00f3n de las prote\u00ednas marcadas radiactivamente unidas a las bbmv es la suma de la uni\u00f3n a diversas mol\u00e9culas. Generalmente se trata en su mayor parte de una uni\u00f3n espec\u00edfica, pero no necesariamente responsable de forma directa de la formaci\u00f3n de poro. cuando cry1ac fue preincubada con el az\u00facar galnac se observ\u00f3 una completa inhibici\u00f3n de la formaci\u00f3n de poro en ambas zonas del intestino medio de h. Armigera y \u00fanicamente en la zona final del intestino medio de m. Sexta. Se concluye que toda la uni\u00f3n efectiva, capaz de formar poro se realiza, en estos casos, a trav\u00e9s de un residuo de galnac del receptor. Receptores candidatos que poseen residuos de galnac son la apn y la m-alp. en la zona inicial del intestino medio de m. Sexta se observ\u00f3 una inhibici\u00f3n parcial de la formaci\u00f3n de poro cuando la prote\u00edna cry1ac fue preincubada con galnac. Se confirma, en esta zona del intestino, la existencia de un mecanismo de formaci\u00f3n de poro independiente de la uni\u00f3n mediante el residuo de galnac. Este mecanismo podr\u00eda ser el responsable de la mayor toxicidad de la prote\u00edna cry1ac para m. Sexta en comparaci\u00f3n con h. Armigera. los experimentos de uni\u00f3n in vitro en presencia de galnac mostraron como m\u00e1ximo una inhibici\u00f3n del 68% de la uni\u00f3n de cry1ac (zona final del intestino medio de h. Armigera). Es decir, el 32% de esta uni\u00f3n ser\u00eda no mediada por galnac correspondiendo a la uni\u00f3n no formadora de poro que sin embargo, es contabilizada como \u00abreceptor\u00bb en los experimentos de uni\u00f3n in vitro. Explicar\u00eda al mismo tiempo porqu\u00e9, en ocasiones, se detecta uni\u00f3n a\u00fan cuando las prote\u00ednas no muestran toxicidad para el insecto. se concluye adem\u00e1s, que el m\u00e9todo de uni\u00f3n in vitro es un m\u00e9todo \u00f3ptimo para realizar caracterizaci\u00f3n de la resistencia en aquellos insectos en los cuales la uni\u00f3n de la prote\u00edna al receptor se ve dram\u00e1ticamente alterada. Pero no es un m\u00e9todo \u00f3ptimo para predecir toxicidad de las prote\u00ednas cry en insectos susceptibles. Por el contrario, el m\u00e9todo de formaci\u00f3n de poro parece correlacionar con la toxicidad de la prote\u00edna cry1ac tanto en h. Armigera como en m. Sexta. iv- efecto de la prote\u00edna cry1ac en chrysoperla carnea: una aproximaci\u00f3n microsc\u00f3pica. el objetivo de este trabajo fue desarrollar una nueva aproximaci\u00f3n metodol\u00f3gica que ayudara a esclarecer la controversia sobre los efectos de los cultivos-bt en la fauna auxiliar y en especial en c. Carnea. se consider\u00f3 adecuado desarrollar una aproximaci\u00f3n microsc\u00f3pica para este estudio ya que la uni\u00f3n espec\u00edfica de las prote\u00ednas cry1 a la membrana epitelial en borde en cepillo del intestino del insecto es un paso necesario para la existencia de toxicidad. Si dichas prote\u00ednas son t\u00f3xicas para c. Carnea debemos encontrarlas unidas en el intestino de este insecto del mismo modo que las encontramos en insectos susceptibles. Los resultados mostraron que la t\u00e9cnica de inmunodetecci\u00f3n de la prote\u00edna cry1ac despu\u00e9s de haber sido ingerida (uni\u00f3n in vivo) permiti\u00f3 localizar la prote\u00edna unida a la membrana peritr\u00f3fica y al epitelio intestinal de las larvas de h. Armigera, para las cuales es conocida su toxicidad. Por el contrario, no se detect\u00f3 la prote\u00edna en el intestino de c. Carnea. mediante tinciones diferenciales se observ\u00f3 alteraci\u00f3n de las estructuras celulares y del epitelio intestinal en h. Armigera mientras que estas estructuras permanecieron inalteradas en c. Carnea. se concluye que no hay evidencias para considerar la prote\u00edna cry1ac t\u00f3xica para c. Carnea. publicaciones resultantes: c.S hern\u00e1ndez, ana rodrigo and juan ferr\u00e9. 2004. \u00abLyophilization of lepidopteran midguts: a preserving method for bt toxin binding studies\u00bb.Journal of invertebrate pathology. 85: 182-187. rodrigo-sim\u00f3n a, de maagd ra, avilla c, bakker pl, molthoff j.Gonz\u00e1lez- zamora je, ferr\u00e9 j.2005. \u00abLack of detrimental effeets of bacillus thuringiensis cry toxins on the insect predator chrysoperla carnea: a toxicological, histopathological, and biochemical analysis\u00bb. Applied and environmental microbiology. 72(2): 1595-603. wang, p., Zhao, j. Z., Rodrigo-sim\u00f3n, a., Kain, w., Janmaat, a. F., Shelton, a. M., Ferr\u00e9, j., Myers, j. 2007. Mechanism of resistance to bacillus thuringiensis toxin cry1ac in a greenhouse population of cabbage looper, trichoplusia ni. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1199-1207. anilkumar, j. K., Rodrigo-sim\u00f3n, a., Ferr\u00e9, j., Pusztai-carey, m., Sivasupramaniam, s., Moar, w. J. 2008. Production and characterization of bacillus thuringiensis cry1ac- resistant cotton bollworm helicoverpa zea (boddie). Appl. Environ. Microbiol. 74(2): 462-469. rodrigo-sim\u00f3n, a., Caccia, s., Ferr\u00e9, j. 2008. Bacillus thuringiensis cry1ac toxin binding and pore-forming in brush border membrane vesicles prepared form anterior and posterior midgut regions of lepidopteran larvae. Appl. Environ. Microbiol. 74(6): 1710-1716.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Cultivos transg\u00e9nicos de bacillus thuringiensis: aparici\u00f3n de resistencia en insectos plaga y efecto sobre fauna auxiliar<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Cultivos transg\u00e9nicos de bacillus thuringiensis: aparici\u00f3n de resistencia en insectos plaga y efecto sobre fauna auxiliar <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Ana Rodrigo Sim\u00f3n <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Universitat de val\u00e9ncia (estudi general)<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 25\/06\/2008<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Juan Ferre Manzanero<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: primitivo Caballero murillo <\/li>\n<li>Carlos Avilla hern\u00e1ndez (vocal)<\/li>\n<li>maris\u00e9 Borja y tom\u00e9 (vocal)<\/li>\n<li>f\u00e9lix Ortego alonso (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Ana Rodrigo Sim\u00f3n En esta tesis se ha estudiado la naturaleza de la resistencia a las prote\u00ednas 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