{"id":65592,"date":"2018-03-09T22:53:41","date_gmt":"2018-03-09T22:53:41","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/structural-studies-of-proteins-and-protein-complexes-by-mass-spectrometry-and-atomic-force-microscopy\/"},"modified":"2018-03-09T22:53:41","modified_gmt":"2018-03-09T22:53:41","slug":"structural-studies-of-proteins-and-protein-complexes-by-mass-spectrometry-and-atomic-force-microscopy","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/quimica-organica\/structural-studies-of-proteins-and-protein-complexes-by-mass-spectrometry-and-atomic-force-microscopy\/","title":{"rendered":"Structural studies of proteins and protein complexes by mass spectrometry and atomic force microscopy"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Stephanie Boussert <\/strong><\/h2>\n<p>Esta tesis se basa en el desarrollo i la utilizaci\u00f3n de aproximaciones basadas en la espectrometr\u00eda de masas para identificar i caracterizar prote\u00ednas o complejos no covalentes de prote\u00ednas.  en primer t\u00e9rmino se ha utilizado la espectrometr\u00eda de masas como una aproximaci\u00f3n alternativa i complementaria a las aproximaciones cl\u00e1sicas de la biolog\u00eda estructural, como son las cristalograf\u00eda, la resonancia magn\u00e9tica nuclear,&#8230; La interacciones d\u00e9biles no covalentes, intra o intermoleculares, juegan un papel dentro de la  estructura i el funcionamiento del sistema biol\u00f3gico. Es por este motivo que es esencial obtener informaci\u00f3n sobre la identidad de los p\u00e9ptidos implicados en estas interacciones. La estructura tridimensional de la subunidad proteica p62 del factor de transcripci\u00f3n tfiih no se conoce. Es por este motivo que hemos desarrollado un m\u00e9todo de identificaci\u00f3n de los p\u00e9ptidos que est\u00e1n enlazados de manera no covalente a la subunidad del factor de transcripci\u00f3n ftiih mediante la t\u00e9cnica de espectrometr\u00eda de masas. Esta subunidad del factor de transcripci\u00f3n ftiih mediante la t\u00e9cnica de espectrometr\u00eda de masas. Esta subunidad se puso en presencia de enzimas de digesti\u00f3n en concentraciones crecientes. el an\u00e1lisis por espectrometr\u00eda de masas de los p\u00e9ptidos resistentes a la digesti\u00f3n y previamente separados mediante un gel de electroforesis unidimensional, nos permiti\u00f3 identificar los residuos organizados en dominios compactos de la secuencia primaria de la prote\u00edna, ofreciendo as\u00ed una apreciaci\u00f3n de su organizaci\u00f3n modular.  la espectrometr\u00eda de masas tambi\u00e9n nos permiti\u00f3, mediante la cromatograf\u00eda de l\u00edquidos y la espectrometr\u00eda de masas en t\u00e1ndem, encontrar evidencias de la mutaci\u00f3n de un amino\u00e1cido en un complejo multiproteico no covalente. Esta mutaci\u00f3n puntual de la cadena beta de la hemoglobina humana, presenta la particularidad de no modificar las propiedades f\u00edsico-qu\u00edmicas de la hemoglobina, esto hace que no sea detectable con otras t\u00e9cnicas electrofor\u00e9ticas cl\u00e1sicas. en segundo lugar, nos interesamos por el estudio de estructuras de prote\u00ednas y de complejos proteicos no covalentes sobre una superficie. La microscopia de fuerzas at\u00f3micas ha sido elegida como la t\u00e9cnica m\u00e1s apropiada para este tipo de estudio. As\u00ed, estudiamos y visualizamos por microscop\u00eda de fuerzas at\u00f3micas, la formaci\u00f3n de fibrillas para el auto ensamblaje de un tetrap\u00e9ptido. este primer resultado nos llev\u00f3 a desarrollar herramientas de an\u00e1lisis para las interacciones proteicas no covalentes, compatibles con las t\u00e9cnicas de nanotecnolog\u00eda y espectrometr\u00eda de masas. As\u00ed pues, funcionalizamos una superficie con el p\u00e9ptido beta amiloide, con la finalidad de caracterizar su interacci\u00f3n con prote\u00ednas. Esta superficie de oro se funcionaliza mediante una cadena alqu\u00edlica con un extremo tiol para asegurar la interacci\u00f3n con la superficie y con el otro extremo un pentaetilenglicol, para evitar una absorci\u00f3n inespec\u00edfica de prote\u00ednas sobre la superficie. Estas cadenas modificadas conten\u00edan una amina libre que permit\u00ed ala introducci\u00f3n de un grupo maleimido, el cual permiti\u00f3 la uni\u00f3n con el p\u00e9ptido beta-amiloide. el p\u00e9ptido beta-amiloide es un p\u00e9ptido implicado en la enfermedad de alzheimer. Su acumulaci\u00f3n y degradaci\u00f3n conducen a la formaci\u00f3n de placas seniles, una de las lesiones observadas en la enfermedad. La tendencia natural de agregaci\u00f3n de este p\u00e9ptido hace que sea muy dif\u00edcil trabajar en soluciones acuosas. Recientes trabajos de s\u00edntesis en fase s\u00f3lida han permitido la s\u00edntesis y purificaci\u00f3n del p\u00e9ptido beta amiloide. La estrategia de s\u00edntesis se basa en la utilizaci\u00f3n de un amino\u00e1cido o-acil en la secuencia del p\u00e9ptido en cuesti\u00f3n para aumentar considerablemente su solubilidad. Una vez obtenido, este o-acil isop\u00e9ptido se puede convertir f\u00e1cilmente en un p\u00e9ptido n-acil (que es el p\u00e9ptido original) mediante una reacci\u00f3n de reorganizaci\u00f3n intramolecular a ph b\u00e1sico. Utilizando este m\u00e9todo obtuvimos sin dificultad el isop\u00e9ptido soluble o-acil beta amiloide. La originalidad de este trabajo se basa en la utilizaci\u00f3n del isop\u00e9ptido soluble o-acil beta-amiloide, para inmovilizarlo principalmente en forma monom\u00e9ricas sobre nuestra superficie y permitir su reconversi\u00f3n en el p\u00e9ptido original v\u00eda reorganizaci\u00f3n molecular directamente sobre la superficie. Esta superficie se caracteriz\u00f3 mediante espectrometr\u00eda de masas y microscop\u00eda de fuerzas at\u00f3micas para asegurar la presencia del p\u00e9ptido beta-amiloide sobre la superficie. demostramos que nuestra superficie funcionarizada con el p\u00e9ptido beta amiloide era funcional y permit\u00eda las interacciones no covalentes p\u00e9ptido-prote\u00edna utilizando un anticuerpo anti-p\u00e9ptido amiloide. Esta interacci\u00f3n antigeno-anticuerpo se observ\u00f3 mediante microscop\u00eda de fuerzas at\u00f3micas. el objetivo a largo plazo es utilizar esta t\u00e9cnica para identificar nuevas interacciones entre el p\u00e9ptido beta amiloide y prote\u00ednas extra\u00eddas de cerebros de pacientes con alzheimer en diferentes estados de la evoluci\u00f3n de la enfermedad. nuestro modelo de interacci\u00f3n sobre superficies se valid\u00f3 con otras prote\u00ednas que interaccionan con el p\u00e9ptido beta amiloide y demostramos su compatibilidad con los m\u00e9todos de prote\u00f3mica actual. As\u00ed pues, realizamos digestiones enzim\u00e1ticas directamente sobre la superficie permitiendo as\u00ed la identificaci\u00f3n de prote\u00ednas mediante espectrometr\u00eda de masas y espectrometr\u00eda de masas en t\u00e1ndem.  en conclusi\u00f3n, la espectrometr\u00eda de masas se ha establecido como herramienta potente para la identificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de prote\u00ednas y complejos proteicos no covalentes. Su sinergia con la microscopia de fuerzas at\u00f3micas nos ha permitido el desarrollo de una superficie apropiada para el estudio de interacciones proteicas no covalentes.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Structural studies of proteins and protein complexes by mass spectrometry and atomic force microscopy<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Structural studies of proteins and protein complexes by mass spectrometry and atomic force microscopy <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Stephanie Boussert <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 25\/06\/2008<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Ernest Giralt Lledo<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: fausto Sanz carrasco <\/li>\n<li>laurence Sabatier (vocal)<\/li>\n<li>felix Elortza basterrika (vocal)<\/li>\n<li>christine Enjalbal (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Stephanie Boussert Esta tesis se basa en el desarrollo i la utilizaci\u00f3n de aproximaciones basadas en la 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