{"id":66465,"date":"2018-03-09T22:54:47","date_gmt":"2018-03-09T22:54:47","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/desarrollo-y-validacion-de-metodologias-enaliticas-para-la-determinacion-de-proteinas-de-soja-en-productos-carnicos-por-cromatografia-liquida-de-perfusion\/"},"modified":"2018-03-09T22:54:47","modified_gmt":"2018-03-09T22:54:47","slug":"desarrollo-y-validacion-de-metodologias-enaliticas-para-la-determinacion-de-proteinas-de-soja-en-productos-carnicos-por-cromatografia-liquida-de-perfusion","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/quimica\/desarrollo-y-validacion-de-metodologias-enaliticas-para-la-determinacion-de-proteinas-de-soja-en-productos-carnicos-por-cromatografia-liquida-de-perfusion\/","title":{"rendered":"Desarrollo y validacion de metodolog\u00edas enaliticas para la determinacion de proteinas de soja en productos carnicos por cromatografia liquida de perfusion"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Florentina Castro Rubio <\/strong><\/h2>\n<p>La adici\u00f3n de prote\u00ednas de soja a productos c\u00e1rnicos crudos y procesados es una pr\u00e1ctica com\u00fan. En el caso de las carnes crudas, las prote\u00ednas de soja pueden ser directamente mezcladas con la carne picada o pueden ser introducidas mediante inyecci\u00f3n por bombeo o masajeo (tecnolog\u00eda tumble) en grandes piezas de tejido c\u00e1rnico. Las razones de la adici\u00f3n de las prote\u00ednas de soja est\u00e1n relacionadas, generalmente, con la mejora de las caracter\u00edsticas de la carne, la reducci\u00f3n del coste de la carne o la reducci\u00f3n del contenido en grasa de la carne. Adem\u00e1s, los productos c\u00e1rnicos procesados normalmente contienen un elevado contenido en grasa y su contenido en prote\u00ednas c\u00e1rnicas suele ser bajo. Debido a que las prote\u00ednas de la carne juegan un papel esencial como emulsificantes, evitando la coalescencia de la grasa durante el calentamiento, cuando el contenido en carne magra (y el contenido en prote\u00ednas c\u00e1rnicas) es bajo, la adici\u00f3n de prote\u00ednas no c\u00e1rnicas como las prote\u00ednas de soja puede aportar el poder emulsificante necesario. Por otro lado, las crecientes demandas de los consumidores por productos m\u00e1s sanos y seguros tambi\u00e9n ha promovido la adici\u00f3n de prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos procesados como sustitutos de la grasa. Adem\u00e1s, las prote\u00ednas de soja presentan interesantes propiedades nutricionales y tambi\u00e9n son ampliamente conocidos los beneficios para la salud que se han asociado con su consumo. \tla creciente utilizaci\u00f3n de las prote\u00ednas no c\u00e1rnicas para la fabricaci\u00f3n de productos c\u00e1rnicos ha sido paralela a las demandas de regulaciones que controlen esta pr\u00e1ctica. Hoy en d\u00eda, todos los pa\u00edses desarrollados han elaborados regulaciones que limitan o, incluso, proh\u00edben la utilizaci\u00f3n de prote\u00ednas no c\u00e1rnicas en la industria c\u00e1rnica. Estas legislaciones no solo regulan la adici\u00f3n de estas prote\u00ednas sino que tambi\u00e9n controlan el adecuado etiquetado de los productos c\u00e1rnicos. La necesidad de estas regulaciones es obvia, adem\u00e1s de las posibles ventajas econ\u00f3micas derivadas de las sustituci\u00f3n de las prote\u00ednas c\u00e1rnicas por otras m\u00e1s baratas (tales como las prote\u00ednas de soja), la mayor parte de las prote\u00ednas no c\u00e1rnicas utilizadas en la industria c\u00e1rnica son alergenos y su adici\u00f3n no declarada podr\u00eda tener consecuencias no deseables para las personas sensibles a ellas. Por ejemplo, en el caso de las prote\u00ednas de soja se han detectado diferentes alergenos.  la implantaci\u00f3n de regulaciones que establecen niveles m\u00e1ximos de prote\u00ednas de soja y controlan el etiquetado de los productos c\u00e1rnicos supone disponer de una adecuada metodolog\u00eda anal\u00edtica que permita determinar la cantidad de prote\u00ednas de soja adicionadas a un producto c\u00e1rnico. Sin embargo, esto no es una tarea sencilla. De hecho, la determinaci\u00f3n de prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos posee bastantes limitaciones, siendo la m\u00e1s importante el hecho de que estas prote\u00ednas est\u00e1n presentes en los productos c\u00e1rnicos en una proporci\u00f3n muy baja en comparaci\u00f3n con las prote\u00ednas c\u00e1rnicas y que las prote\u00ednas de soja podr\u00edan resultar alteradas durante el procesamiento del producto c\u00e1rnico. Todos estos hechos han dificultado e incluso han impedido la detecci\u00f3n de las prote\u00ednas de soja. Diferentes m\u00e9todos electrofor\u00e9ticos, inmunol\u00f3gicos y cromatogr\u00e1ficos han sido desarrollados para la determinaci\u00f3n de prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos aunque la mayor parte de ellos presenta importantes limitaciones, especialmente en el caso de los productos c\u00e1rnicos procesados con calor. debido a la ausencia de m\u00e9todos anal\u00edticos fiables, en este trabajo, se han desarrollado y validado nuevas metodolog\u00edas anal\u00edticas para la determinaci\u00f3n de prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos crudos y procesados utilizando hplc con fases estacionarias perfusivas.  \tlas metodolog\u00edas desarrolladas consist\u00edan en el desgrasado de las muestra con acetona, solubilizaci\u00f3n de las prote\u00ednas de soja en un medio salino a ph b\u00e1sico y an\u00e1lisis de las prote\u00ednas extra\u00eddas por cromatograf\u00eda l\u00edquida de alta eficacia en fase inversa (rp-hplc) de perfusi\u00f3n con detecci\u00f3n uv y eluci\u00f3n en gradiente. Tambi\u00e9n se han optimizado las etapas de extracci\u00f3n y separaci\u00f3n.  las mejores condiciones que permit\u00edan la extracci\u00f3n de las prote\u00ednas de soja utilizaban una disoluci\u00f3n reguladora tris-hcl a un ph 8.0 (que en algunos casos pod\u00eda contener un modificador) con agitaci\u00f3n ultras\u00f3nica y centrifugaci\u00f3n obteniendo un sobrenadante que era directamente inyectado en el sistema cromatogr\u00e1fico.  el m\u00e9todo de rp-hplc de perfusion elegido consist\u00eda en un gradiente lineal y binario en tres etapas: 5-25 % b en 0.8 min, 25-42 % b en 0.8 min, 42-50 % b en 0.6 min, y finalmente 50-5 % b en 0.5 min para equilibrar la columna en las condiciones iniciales entre inyecciones, siendo la fase m\u00f3vil a y b, 0.05 % (v\/v) de \u00e1cido trifluoroac\u00e9tico en agua y 0.05 % (v\/v) de \u00e1cido trifluoroac\u00e9tico en acetonitrilo, respectivamente. Se emple\u00f3 una columna de perfusion en fase inverse (50 x 4.6 mm d.I.) Empaquetada con part\u00edculas de 10 \u00c2\u00bfm de di\u00e1metro de poliestireno-divinilbenzeno, un flujo de fase m\u00f3vil de 3 ml\/min, una temperatura durante la separaci\u00f3n de 50 \u00c2\u00bac y detecci\u00f3n uv a 280 nm. En estas condiciones, la separaci\u00f3n cromatogr\u00e1fica de los extractos proteicos se obtuvo en menos de 3 min. el m\u00e9todo desarrollado permiti\u00f3 la selecci\u00f3n de un pico \u00abmarcador\u00bb para la determinaci\u00f3n de prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos. Adem\u00e1s, se comprob\u00f3 que esta metodolog\u00eda era espec\u00edfica, precisa, exacta, robusta, y sensible siendo posible la detecci\u00f3n y cuantificaci\u00f3n de adiciones de ~ 0.08 % (m\/m) y ~ 0.3 % (m\/m), respectivamente, de prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos. La validaci\u00f3n de las metodolog\u00edas desarrolladas se realiz\u00f3 tanto para productos c\u00e1rnicos crudos como procesados con diferente composici\u00f3n (elaborados con carnes de cerdo, pavo, pollo y ternera o mezclas de ellos) mostrando, adem\u00e1s, que la presencia de prote\u00ednas l\u00e1cteas en los productos c\u00e1rnicos no interfer\u00eda en la medida de las prote\u00ednas de soja.  \tla cuantificaci\u00f3n de las prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos procesados con calor comerciales y con diferente composici\u00f3n (elaborados con carnes de diferentes especies que podr\u00edan contener prote\u00ednas l\u00e1cteas) se realiz\u00f3 utilizando un aislado de prote\u00edna de soja como patr\u00f3n de prote\u00ednas de soja. Los resultados obtenidos mostraron que los contenidos en prote\u00ednas de soja determinados en productos c\u00e1rnicos comerciales estaban dentro del l\u00edmite establecido por la legislaci\u00f3n espa\u00f1ola (3% de prote\u00ednas de soja referido a producto c\u00e1rnico inicial). con el objetivo de caracterizar los picos cromatogr\u00e1ficos obtenidos con las metodolog\u00edas desarrolladas para las prote\u00ednas de soja, se acopl\u00f3 la rp-hplc de perfusi\u00f3n a un espectr\u00f3metro de masas para analizar, por primera vez, las prote\u00ednas de soja intactas en diferentes tipos de cultivos de soja. Las separaciones se realizaron en una columna de fase inversa de perfusi\u00f3n (100 x 2.1 mm d.I.) A un flujo de 0.5 ml\/min, una temperatura de 60 \u00c2\u00bac, y eluci\u00f3n con un gradiente de 5 a 14 % b en 12 min, 14-16% b en 1 min, 16-20% b en 2 min, 20-28% b en 1 min, 28-40% en 8 min, 40-45% b en 2 min, y 45-95% b en 0.5 min. Las fases m\u00f3viles a y b consist\u00edan en un 0.05% (v\/v) de \u00e1cido trifluoroac\u00e9tico en agua y 0.05% (v\/v) de \u00e1cido trifluoroac\u00e9tico en acetonitrilo, respectivamente. Se ha utilizado un procedimiento por pasos para optimizar los par\u00e1metros del espectr\u00f3metro de masas de trampa de iones con electronebulizaci\u00f3n que permitiera la detecci\u00f3n m\u00e1s sensible. Se ha investigado la influencia que el potencial del capilar, el potencial de octapolo, el potencial de octapolo delta, el potencial a la salida del capilar y el potencial del skim ten\u00edan sobre la se\u00f1al. Se ha elegido un potencial de capilar de 3 kv ya que permit\u00eda observar la mayor se\u00f1al no observando ninguna mejora significativa al utilizar potenciales mayores. El potencial de octapolo seleccionado para la detecci\u00f3n sensible de las prote\u00ednas de soja fue 4 v y el potencial de octapolo delta que mejores resultados mostraba fue 0.5 v. El menor potencial probado a la salida del capilar (50 v) fue el que result\u00f3 dar las respuestas m\u00e1s altas. Con respecto al potencial del skim, las respuestas m\u00e1s elevadas se observaron para valores intermedios seleccionando 45 kv. el an\u00e1lisis por rp-hplc-esi-ms de perfusi\u00f3n de los cultivos de soja mostr\u00f3 que el pico cromatogr\u00e1fico obtenido para los cultivos de soja al tiempo de retenci\u00f3n del pico seleccionado como \u00abmarcador\u00bb de las prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1nticos correspond\u00eda a las prote\u00ednas 11s de la soja. Adem\u00e1s, de este trabajo se deriv\u00f3 una interesante aplicaci\u00f3n. se han investigado las similitudes y diferencias entre las habas de soja amarillas (las m\u00e1s habituales) y otras habas con diferente pigmentaci\u00f3n (verde, rojo y negro) comercializadas como soja utilizando el m\u00e9todo de rp-hplc-esi-ms de perfusi\u00f3n desarrollado. Adem\u00e1s, tambi\u00e9n se han analizados habas rojas comercializadas como azuki id\u00e9nticas a las habas rojas frecuentemente comercializadas como soja roja y fracciones proteicas (globulinas 11s y 7s) obtenidas por un procedimiento de fraccionamiento. las habas con la misma coloraci\u00f3n presentaban los mismos tic, independientemente de que se hubieran adquirido como soja o no (azuki). Adem\u00e1s, las habas amarillas presentaban un tic muy diferente del observado para otras habas estudiadas (rojas, verdes o negras) con la excepci\u00f3n de un haba de soja negra. De hecho, algunos picos de las habas de soja amarilla fueron asignados a algunas prote\u00ednas caracter\u00edsticas de la soja mientras que esta asignaci\u00f3n no fue posible para las habas con otra coloraci\u00f3n. El fraccionamiento de las principales prote\u00ednas de soja (globulinas 7s y 11s) se realiz\u00f3 para todas las habas estudiadas y su an\u00e1lisis por rp-hplc-esi-ms de perfusi\u00f3n permiti\u00f3 confirmar las diferencias encontradas entre las habas de soja amarillas y las habas con otra pigmentaci\u00f3n. Una aplicaci\u00f3n de inter\u00e9s derivada de este trabajo fue la diferenciaci\u00f3n de soja de otros cultivos similares (azuki or mungbean). finalmente, debido a las dificultades relacionadas en la caracterizaci\u00f3n del pico \u00abmarcador\u00bb de las prote\u00ednas de soja en productos c\u00e1rnicos mediante la utilizaci\u00f3n del m\u00e9todo rp-hplc-esi-ms de perfusi\u00f3n propuesto, se desarroll\u00f3 un nuevo m\u00e9todo de cromatograf\u00eda l\u00edquida multidimensional acoplada a espectrometr\u00eda de masas en t\u00e1ndem. El aislamiento de los picos de inter\u00e9s a partir de extractos de aislado de prote\u00edna de soja (spi) y de los productos c\u00e1rnicos elaborados con spi se realiz\u00f3 por rp-hplc de perfusi\u00f3n. Tras la digesti\u00f3n enzim\u00e1tica con tripsina, las fracciones recogidas fueron analizadas por nanocromatograf\u00eda de l\u00edquidos de alta eficacia- espectrometr\u00eda de masas en t\u00e1ndem. Los resultados obtenidos permitieron la identificaci\u00f3n de las prote\u00ednas de soja contenidas en el pico marcador que permit\u00edan la detecci\u00f3n de adulteraciones de productos c\u00e1rnicos con estas prote\u00ednas vegetales. \t se identificaron diferentes subunidades de la glicinina a en el pico que permit\u00eda la discriminaci\u00f3n entre productos c\u00e1rnicos con y sin prote\u00ednas de soja. Entre estas, la subunidad a4 de la variedad g4 de la glicinina se encontr\u00f3 en todas las muestras. Consecuentemente, esta prote\u00edna (subunidad) puede ser utilizada como diana en nuevas tecnolog\u00edas anal\u00edticas para la identificaci\u00f3n de la adici\u00f3n de prote\u00ednas de soja a productos c\u00e1rnicos.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Desarrollo y validacion de metodolog\u00edas enaliticas para la determinacion de proteinas de soja en productos carnicos por cromatografia liquida de perfusion<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Desarrollo y validacion de metodolog\u00edas enaliticas para la determinacion de proteinas de soja en productos carnicos por cromatografia liquida de perfusion <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Florentina Castro Rubio <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Alcal\u00e1<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 18\/07\/2008<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Mar\u00eda  Luisa Marina Alegre<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: manuel Hern\u00e1ndez c\u00f3rdoba <\/li>\n<li>Mar\u00eda  Jos\u00e9 Gonzalez Carlos (vocal)<\/li>\n<li>carmen Garcia ruiz (vocal)<\/li>\n<li>pilar Fernandez hernando (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Florentina Castro Rubio La adici\u00f3n de prote\u00ednas de soja a productos c\u00e1rnicos crudos y procesados es una 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