{"id":68119,"date":"2018-03-09T22:56:33","date_gmt":"2018-03-09T22:56:33","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/actividades-glicosidasas-sobre-el-xiloglucano-de-la-pared-celular-de-arabidopsis-thaliana\/"},"modified":"2018-03-09T22:56:33","modified_gmt":"2018-03-09T22:56:33","slug":"actividades-glicosidasas-sobre-el-xiloglucano-de-la-pared-celular-de-arabidopsis-thaliana","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/santiago-de-compostela\/actividades-glicosidasas-sobre-el-xiloglucano-de-la-pared-celular-de-arabidopsis-thaliana\/","title":{"rendered":"Actividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la pared celular de arabidopsis thaliana"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Natalia Iglesias M\u00e9ndez <\/strong><\/h2>\n

La pared celular es uno de los componentes m\u00e1s caracter\u00edsticos de la c\u00e9lula vegetal, puesto que posee funciones de vital importancia entre las que se encuentra darle forma (bacic et al, 1988) y posibilitar su crecimiento. Podemos diferenciar las paredes celulares por su composici\u00f3n, pero tambi\u00e9n por su estado fisiol\u00f3gico (pared celular primaria y pared celular secundaria). Nuestro estudio se centra en la pared celular primaria, que posee capacidad de crecimiento (cosgrove, 1993b; 1996), y est\u00e1 compuesta fundamentalmente por polisac\u00e1ridos, peque\u00f1as cantidades de glicoprote\u00ednas, fenoles y, en algunos tipos celulares especializados, sustancias tales como la lignina, cutina, suberina o s\u00edlice (fry, 2004). Las hemicelulosas m\u00e1s habituales son los xilanos, el xiloglucano y el glucano mixto. El estudio de las enzimas implicadas en la modificaci\u00f3n del xiloglucano y sus efectos sobre la pared celular, es el objetivo de nuestro trabajo. Hay cuatro glicanasas capaces de actuar sobre el xiloglucano y\/o sus oligosacaridos (alfa-xilosidasa, alfa-fucosidasa, beta-glucosidasa y beta-galactosidasa) que se encuentran en el apoplasto de arabidopsis thaliana, y concretamente, nos centramos en las actividades enzim\u00e1ticas beta-glucosidasa y beta-galactosidasa. inicialmente se comprob\u00f3 la presencia, en el apoplasto de plantas de arabidopsis thaliana, de dichas enzimas, necesarias para degradar los oligosac\u00e1ridos de xiloglucano. Para ello se incub\u00f3 una soluci\u00f3n de oligosac\u00e1ridos de xiloglucano, se sigui\u00f3 la reacci\u00f3n y sus productos mediante maldi-tof, y a continuaci\u00f3n se realiz\u00f3 una b\u00fasqueda exhaustiva de las posibles beta-glucosidasas y beta-galactosidasas apopl\u00e1sticas de arabidopsis que pudiesen estar involucradas en el metabolismo del xiloglucano y\/o de sus oligosac\u00e1ridos y por lo tanto en la extensi\u00f3n de la pared celular. Se encontraron cuatro posibles beta-glucosidasas de la familia 3 de las glicosil hidrolasas y doce beta-galactosidasas de la familia 35. Esto nos ha permitido, demostrar la existencia en el apoplasto de arabidopsis de las glicanasas necesarias para la completa degradaci\u00f3n del xiloglucano y\/o de sus oligosac\u00e1ridos. Estos resultados forman parte de una publicaci\u00f3n (plant cell physiology 47: 55-63) que lleva por t\u00edtulo #apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of arabidopsis thaliana#. en el caso de las glucosidasas, hemos llevado a cabo un an\u00e1lisis de los promotores, mediante construcciones de fusi\u00f3n de dichas regiones con el gen gus, lo cual nos ha permitido localizar los lugares de expresi\u00f3n de dichos genes y determinar la mayor o menor expresi\u00f3n de los mismos. para los diecis\u00e9is genes que codifican para las prote\u00ednas en estudio (cuatro glucosidasas y doce galactosidasas) hemos obtenido los mutantes knockout correspondientes, y tras ser sometidos a una selecci\u00f3n, se ha analizado la estructura del xiloglucano de sus paredes celulares mediante maldi-tof. Lo cual nos ha permitido seleccionar los mutantes knockout cuyas paredes celulares presentan una composici\u00f3n oligosacar\u00eddica que nos permita establecer una relaci\u00f3n entre la composici\u00f3n de su xiloglucano y la afuncionalidad de la encima mutada, adem\u00e1s, el apoplasto de estos mutantes se ha incubado con oligosac\u00e1ridos de xiloglucano y los resultados se han analizado mediante maldi-tof, para determinar si la falta de la actividad encim\u00e1tica correspondiente se puede relacionar con los productos obtenidos. Se ha llevado a cabo un estudio de la composici\u00f3n de az\u00facares en las paredes celulares de algunos mutantes de inter\u00e9s mediante espectrometr\u00eda de masas, y se ha estudiado su cin\u00e9tica de crecimiento en base al di\u00e1metro de su roseta basal. Adem\u00e1s se ha hecho un estudio de las alteraciones fenot\u00edpicas que presentan los distintos mutantes knockout. mediante pcr en tiempo real, hemos estudiado la expresi\u00f3n de los cuatro genes que codifican para beta-glucosidasas y los doce que codifican para #-galactosidasas, as\u00ed determinamos cuales presentaban diferencias de expresi\u00f3n en distintos estad\u00edos de madurez (zonas en crecimiento activo y zonas que ya han cesado su crecimiento).El estudi\u00f3 comprendi\u00f3 expresi\u00f3n en hojas (j\u00f3venes y maduras), tallo (apical y basal), ra\u00edces, silicuas y flores. Determinamos los niveles de actividad beta-glucosidasa y beta-galactosidasa en apoplasto y hojas, frente a sustratos comerciales, adem\u00e1s de las cantidades de prote\u00edna correspondientes, por colorimetr\u00eda. A parte de sustratos artificiales, que dan actividad relativa, utilizamos posteriormente sustratos naturales, concretamente para las glucosidasas utilizamos el oligosac\u00e1rido xxxg mientras que para las galactosidasas se utilizaron diferentes oligosac\u00e1ridos, como xlfg o xllg, as\u00ed determinamos la temperatura \u00f3ptima de dichas encimas, y adem\u00e1s obtuvimos niveles de actividad in vivo. en relaci\u00f3n a las beta-glucosidasas en estudio, el gen que codifica una de ellas at5g20940, presenta mayores niveles de expresi\u00f3n en zonas j\u00f3venes que en zonas maduras, puesto que las zonas j\u00f3venes est\u00e1n en crecimiento activo la encima codificada por este gen podr\u00eda estar implicada en la extensi\u00f3n de la pared celular. El estudio de los mutantes knockout de las cuatro glucosidasas objeto de estudio, ha puesto de manifiesto que una de ellas at5g20950 presenta una composici\u00f3n de oligosac\u00e1ridos muy diferente al silvestre (columbia 0). Cuando se incuba el apoplasto de dicho mutante frente al oligosac\u00e1rido xxxg, aparece una ausencia total de actividad glucosidasa, lo cual podr\u00eda indicar que esta encima es la glucosidasa que lleva a cabo la degradaci\u00f3n de dicho oligosac\u00e1rido. Las regiones de la planta en las que se expresan at5g20940 y 20950 as\u00ed como los niveles de expresi\u00f3n son los mismos, lo cual podr\u00eda indicar una estrecha relaci\u00f3n entre ambos genes. El mutante knockout at5g209504d que hemos seleccionado, correspondiente al gen at5g20950, presenta un crecimiento alterado, ya que alcanza un tama\u00f1o superior al del silvestre, y una velocidad de crecimiento tambi\u00e9n mayor. en cuanto a las galactosidasas, presentan una gran variabilidad en relaci\u00f3n a los niveles de expresi\u00f3n, as\u00ed, en ra\u00edces el gen at4g26140 es el que presenta mayor expresi\u00f3n, los genes at3g52840, at4g26140, at2g28470 y at1g77410 presentan mayor expresi\u00f3n en hojas j\u00f3venes y parte apical del tallo si la comparamos con hojas maduras y parte basal del tallo, esto podr\u00eda determinar una relaci\u00f3n entre estos genes y la capacidad de crecimiento, por otro lado el gen at5g56870 presenta un patr\u00f3n de expresi\u00f3n opuesto a los anteriores y los genes at3g13750, at5g63810, at1g31740 y at2g16730 se expresan m\u00e1s en la parte apical del tallo y en hojas maduras. El estudio de los mutantes knockout nos ha permitido seleccionar aquellos que presentan mayores alteraciones en su xiloglucano con respecto al silvestre y relacionarlas con variaciones fenot\u00edpicas y de crecimiento, pero debido a la gran variabilidad no se ha podido seleccionar una \u00fanica galactosidasa que act\u00fae sobre el xiloglucano y\/o sus oligosac\u00e1ridos, sino que se supone que son varias conjuntamente las que pueden modificarlo, y por lo tanto ser\u00edan varias las que estar\u00edan implicadas en la extensi\u00f3n de la pared celular.<\/p>\n

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Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abActividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la pared celular de arabidopsis thaliana<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
    \n
  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Actividades glicosidasas sobre el xiloglucano de la pared celular de arabidopsis thaliana <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Natalia Iglesias M\u00e9ndez <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 21\/11\/2008<\/li>\n<\/ul>\n

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    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
      \n
    • Director de la tesis<\/strong>\n
        \n
      • Ignacio Zarra Cameselle<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
          \n
        • Presidente del tribunal: Antonio Ballester alvarez pardi\u00f1as <\/li>\n
        • Jos\u00e9 Luis Acebes arranz (vocal)<\/li>\n
        • ester P\u00e9rez lorences (vocal)<\/li>\n
        • emilia Labrador encinas (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

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