{"id":90896,"date":"2018-03-11T10:09:32","date_gmt":"2018-03-11T10:09:32","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/estudios-sobre-la-induccion-de-tolerancia-inmunologica-mediante-la-expresion-de-anta%c2%adgenos-en-celulas-hematopoyeticas-murinas-aplicacion-en-un-modelo-experimental-de-enfermedad-autoinmune\/"},"modified":"2018-03-11T10:09:32","modified_gmt":"2018-03-11T10:09:32","slug":"estudios-sobre-la-induccion-de-tolerancia-inmunologica-mediante-la-expresion-de-anta%c2%adgenos-en-celulas-hematopoyeticas-murinas-aplicacion-en-un-modelo-experimental-de-enfermedad-autoinmune","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/barcelona\/estudios-sobre-la-induccion-de-tolerancia-inmunologica-mediante-la-expresion-de-anta%c2%adgenos-en-celulas-hematopoyeticas-murinas-aplicacion-en-un-modelo-experimental-de-enfermedad-autoinmune\/","title":{"rendered":"Estudios sobre la inducci\u00f3n de tolerancia inmunol\u00f3gica mediante la expresi\u00f3n de ant\u00edgenos en c\u00e9lulas hematopoy\u00e9ticas murinas. aplicaci\u00f3n en un modelo experimental de enfermedad autoinmune"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Herena Eixarch Ahufinger <\/strong><\/h2>\n<p>La terapia g\u00e9nica naci\u00f3 a principios de los a\u00f1os 90 como una estrategia para la sustituci\u00f3n de genes defectuosos en determinadas c\u00e9lulas o tejidos en el \u00e1mbito de las enfermedades hereditarias, aunque desde entonces se han desarrollado m\u00faltiples estrategias para tratar enfermedades adquiridas, que incluyen diferentes tipos de c\u00e1ncer o enfermedades autoinmunes como la esclerosis m\u00faltiple (ms). La ms es una enfermedad cr\u00f3nica, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (snc), mediada por c\u00e9lulas t cd4+, cuyos da\u00f1os se traducen cl\u00ednicamente en par\u00e1lisis y discapacidad. La encefalomielitis autoinmune experimental (eae) es el modelo animal de la ms, con la que comparte m\u00faltiples caracter\u00edsticas cl\u00ednicas e histopatol\u00f3gicas.  la creaci\u00f3n de quimerismos moleculares mediante la expresi\u00f3n de transgenes en el sistema hematopoy\u00e9tico se ha asociado a la tolerizaci\u00f3n por parte del sistema inmune frente a estos transgenes. En este trabajo proponemos expresar un ant\u00edgeno candidato de la ms (el p\u00e9ptido 40-55 de la glicoprote\u00edna miel\u00ednica de los oligodendrocitos) en el sistema hematopoy\u00e9tico murino con la finalidad de inducir tolerancia frente a \u00e9ste. Utilizando procedimientos lo m\u00e1s cercanos posible a la cl\u00ednica humana, hemos comprobado que la creaci\u00f3n de quimerismo molecular utilizando el autoant\u00edgeno previene muy eficazmente la enfermedad, mientras que en animales con eae establecida, el trasplante de c\u00e9lulas hematopoy\u00e9ticas expresando el autoant\u00edgeno mejora significativamente la enfermedad, si bien no se llega a crear quimerismo molecular, lo que permite obviar por completo el uso de tratamientos mieloablativos y hace m\u00e1s factible la aplicabilidad cl\u00ednica de este tipo de estrategia terap\u00e9utica.  adem\u00e1s, a ra\u00edz de estos experimentos hemos descubierto que el nivel de expresi\u00f3n de un transg\u00e9n potencialmente inmunog\u00e9nico (egfp) en el contexto del trasplante hematopoy\u00e9tico en ratones sometidos a mieloablaci\u00f3n parcial puede ser determinante en que se induzca tolerancia o se rechacen las c\u00e9lulas transducidas.  objetivos  1-   establecer un r\u00e9gimen de acondicionamiento que no afecte al curso cl\u00ednico de la eae.  2-   determinar si la expresi\u00f3n de mog40-55 en el sistema hematopoy\u00e9tico protege a los animales de desarrollar la eae de forma preventiva utilizando una estrategia de trasplante hematopoy\u00e9tico parcialmente mieloablativo.  \t\u00c2\u00b7   determinar si niveles bajos de quimerismo molecular son suficientes para inducir tolerancia inmunol\u00f3gica.  3-   determinar si esta misma estrategia, pero aplicada a animales con eae establecida, produce una remisi\u00f3n o mejor\u00eda de la enfermedad.   4-\tdeterminar si el nivel de expresi\u00f3n de la egfp en c\u00e9lulas hematopoy\u00e9ticas transducidas y trasplantadas en ratones sometidos a mieloablaci\u00f3n parcial es determinante en la inducci\u00f3n de una respuesta inmune o de tolerancia frente al producto de dicho transg\u00e9n.  metodolog\u00eda  la eae se induce inmunizando cepas de rata y rat\u00f3n susceptibles con p\u00e9ptidos o prote\u00ednas presentes en la vaina de mielina. En este proyecto se indujo la eae en ratones de la cepa sjl con el p\u00e9ptido 139-155 de la prote\u00edna proteolip\u00eddica (plp) y en la cepa c57bl\/6j inmunizados con el p\u00e9ptido 40-55 de la glicoprote\u00edna miel\u00ednica de los oligodendrocitos (mog40-55). En primer lugar se evalu\u00f3 el efecto de distintos reg\u00edmenes de acondicionamiento (4 gy de irradiaci\u00f3n corporal total (ict), 2 x 20 mg\/kg de busulf\u00e1n y 1000 mg\/kg de treosulf\u00e1n) en el curso cl\u00ednico de la eae. Una vez establecido el r\u00e9gimen adecuado para realizar los estudios de tolerancia, se dise\u00f1\u00f3 un vector retroviral que conten\u00eda una construcci\u00f3n con la secuencia codificante para el p\u00e9ptido mog40-55 sustituyendo a la regi\u00f3n clip de la cadena invariante murina (li), que denominamos limog, junto a la secuencia codificante de la egfp como marcador. Se generaron l\u00edneas celulares estables productoras del vector retroviral para la transducci\u00f3n de las c\u00e9lulas murinas hematopoy\u00e9ticas. Como control se utiliz\u00f3 un vector que contiene la secuencia codificante para la li murina y la egfp y un segundo vector control que \u00fanicamente codificaba para la egfp. Se acondicion\u00f3 a los ratones receptores con busulf\u00e1n, y posteriormente fueron trasplantados con aproximadamente 106 c\u00e9lulas de m\u00e9dula \u00f3sea (mo) transducidas. A los animales inmunizados antes o despu\u00e9s del trasplante, se les valor\u00f3 diariamente el curso cl\u00ednico de la eae y al final del experimento se sacrificaron para realizar estudios de injerto y quimerismo molecular, inmunol\u00f3gicos e histopatolog\u00eda.  para estudiar la influencia del nivel de expresi\u00f3n de transgenes sobre la inducci\u00f3n tolerancia inmunol\u00f3gica, se acondicionaron a los receptores con busulf\u00e1n o con ict. Posteriormente se trasplantaron con c\u00e9lulas de mo transducidas con un vector que induce la expresi\u00f3n de niveles elevados de egfp y un segundo vector que induce la expresi\u00f3n de niveles m\u00e1s moderados de egfp. Se estudi\u00f3 el nivel de injerto y quimerismo, as\u00ed como la presencia de anticuerpos espec\u00edficos para egfp.  resultados  el treosulf\u00e1n (1000 mg\/kg) administrado antes de inducir la eae empeor\u00f3 significativamente el curso cl\u00ednico de \u00e9sta. Y lo mismo ocurri\u00f3 con la ict (4 gy) tanto si se administraba antes como despu\u00e9s de la inducci\u00f3n de la eae. Contrariamente, el acondicionamiento con busulf\u00e1n (2 x 20 mg\/kg) no alter\u00f3 el curso cl\u00ednico de la enfermedad, por ello se us\u00f3 como r\u00e9gimen de acondicionamiento en el resto de experimentos. en el brazo preventivo, a los 21 d\u00edas post-trasplante los ratones fueron inmunizados con el p\u00e9ptido encefalitog\u00e9nico mog40-55. Observamos que un n\u00famero elevado de los ratones trasplantados con la mo transducida con limog (8\/13), estaban completamente protegidos frente a la eae, mientras que en los grupos control la mayor\u00eda desarroll\u00f3 la enfermedad [control de enfermedad (14\/15) y egfp (11\/13); p<0,01]. Adem\u00e1s, los pocos animales que enfermaban sufr\u00edan una eae menos severa en cuanto a la m\u00e1xima puntuaci\u00f3n cl\u00ednica alcanzada [mog40-55: 0,9\u00c2\u00b11,5; egfp (control de transplante): 3,5\u00c2\u00b11,7; eae (control de enfermedad): 3,7\u00c2\u00b11,0; p<0,001] y a la puntuaci\u00f3n cl\u00ednica acumulada [mog40-55: 8,2\u00c2\u00b118,7; egfp: 58,4\u00c2\u00b129,2; eae: 63,0\u00c2\u00b127,5; p<0,001], lo que indicaba una protecci\u00f3n parcial.  respecto al brazo terap\u00e9utico, se han obtenido resultados valorables de tres experimentos independientes. Se trasplant\u00f3 mo transducida cuando la enfermedad estaba establecida en la mayor\u00eda de los ratones. Los ratones trasplantados con el vector que expresaba el transg\u00e9n limog quedaban tolerizados, remitiendo total o parcialmente los signos cl\u00ednicos de la enfermedad (limog: 72,7%), mientras que el porcentaje de ratones que remiti\u00f3 los signos cl\u00ednicos en ambos grupos control fue inferior [li (control de trasplante): 30,4%; eae (control de enfermedad): 5,3%; p<0,001). En los cultivos de esplenocitos de los ratones del grupo limog se hallaron niveles m\u00e1s elevados de il-10 e il-5, dos citoquinas que, entre otras, son secretadas por c\u00e9lulas t reguladoras de tipo 1 (tr1), lo que sugiere una posible implicaci\u00f3n de \u00e9stas en la inducci\u00f3n de tolerancia conseguida en este modelo.  observamos que los ratones del grupo limog rechazaban espec\u00edficamente las c\u00e9lulas transducidas, lo que implicaba que la tolerancia se estaba induciendo en ausencia de quimerismo molecular. Por esta raz\u00f3n nos planteamos realizar esta misma aproximaci\u00f3n terap\u00e9utica en animales no sometidos a acondicionamiento alguno. Se consigui\u00f3 mejorar los signos cl\u00ednicos de los ratones, siendo la puntuaci\u00f3n cl\u00ednica acumulada significativamente m\u00e1s baja en los ratones del grupo limog (limog: 26,9 \u00c2\u00b1 21 versus li: 47,6 \u00c2\u00b1 6,8; p<0,05). Estos hallazgos indican que el injerto de las c\u00e9lulas transducidas no es necesario para obtener un efecto tolerog\u00e9nico cl\u00ednicamente beneficioso.  respecto al estudio del potencial inmunog\u00e9nico de la egfp, se hall\u00f3 que la mayor\u00eda de ratones acondicionados con busulf\u00e1n y trasplantados con c\u00e9lulas de mo que expresaban niveles altos de egfp, a pesar de tener injerto del donante, rechazaron espec\u00edficamente las c\u00e9lulas transducidas (23\/36), en contraposici\u00f3n a s\u00f3lo 7 de los 36 ratones que recibieron c\u00e9lulas de mo con expresi\u00f3n moderada de egfp. Se evalu\u00f3 la concentraci\u00f3n de anticuerpos anti-egfp y no se observaron diferencias entre los diferentes grupos, lo que sugiere que la inmunidad humoral no juega un papel importante en estas respuestas inmunitarias.  conclusiones  1-   la creaci\u00f3n de quimerismo molecular con p\u00e9ptido encefalitog\u00e9nico mog40-55 en el sistema hematopoy\u00e9tico murino previene la eae.  2- en la aproximaci\u00f3n preventiva, el nivel de quimerismo molecular no est\u00e1 relacionado con la inducci\u00f3n de tolerancia. Los ratones que quedaron protegidos de la eae presentaban niveles de quimerismo molecular similares a los de los ratones protegidos frente a la enfermedad.  3- el trasplante de c\u00e9lulas de mo expresando el p\u00e9ptido mog40-55 cuando la enfermedad estaba establecida (aproximaci\u00f3n terap\u00e9utica) consigui\u00f3 mejorar los signos cl\u00ednicos y la histopatolog\u00eda de la eae, resultando en una remisi\u00f3n de la enfermedad en una fracci\u00f3n significativa de los animales.  4-   en la aproximaci\u00f3n terap\u00e9utica, las c\u00e9lulas transducidas fueron rechazadas espec\u00edficamente en los ratones del grupo limog. A pesar de ello, se observ\u00f3 un claro beneficio cl\u00ednico. 5- la inducci\u00f3n de tolerancia en ausencia de quimerismo molecular y la precoz mejor\u00eda de los signos cl\u00ednicos tras el trasplante de las c\u00e9lulas transducidas sugiere que la tolerancia inducida en este modelo de eae es perif\u00e9rica y no central. La elevada expresi\u00f3n de il-5 e il-10 sugiere que, en este modelo, la tolerancia est\u00e1 mediada por c\u00e9lulas t reguladoras. 6- la terapia en ausencia de acondicionamiento es igualmente efectiva, haciendo que el procedimiento terap\u00e9utico sea mucho m\u00e1s exportable a la cl\u00ednica humana. 7-   el nivel de expresi\u00f3n del transg\u00e9n en las c\u00e9lulas trasplantadas constituye un factor determinante en la inducci\u00f3n de tolerancia o de respuestas inmunitarias frente a las c\u00e9lulas transducidas. Este hecho es relevante para el dise\u00f1o de vectores y protocolos de terapia g\u00e9nica.\n\n\n\n&nbsp;\n\n\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Estudios sobre la inducci\u00f3n de tolerancia inmunol\u00f3gica mediante la expresi\u00f3n de ant\u00edgenos en c\u00e9lulas hematopoy\u00e9ticas murinas. aplicaci\u00f3n en un modelo experimental de enfermedad autoinmune<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Estudios sobre la inducci\u00f3n de tolerancia inmunol\u00f3gica mediante la expresi\u00f3n de ant\u00edgenos en c\u00e9lulas hematopoy\u00e9ticas murinas. aplicaci\u00f3n en un modelo experimental de enfermedad autoinmune <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Herena Eixarch Ahufinger <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 18\/12\/2008<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Jordi Barquinero Ma\u00f1ez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Juan  Antonio Bueren roncero <\/li>\n<li>mar Tintore subirana (vocal)<\/li>\n<li>eva Mart\u00ednez c\u00e1ceres (vocal)<\/li>\n<li>joan Verdaguer autonell (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Herena Eixarch Ahufinger La terapia g\u00e9nica naci\u00f3 a principios de los a\u00f1os 90 como una estrategia para 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