{"id":90917,"date":"2018-03-11T10:09:32","date_gmt":"2018-03-11T10:09:32","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/analisis-de-expresion-genica-multiple-aplicado-al-estudio-de-los-mecanismos-antiproliferativos-sobre-celulas-de-cancer-de-colon-de-un-alimento-rico-en-compuestos-fenolicos\/"},"modified":"2018-03-11T10:09:32","modified_gmt":"2018-03-11T10:09:32","slug":"analisis-de-expresion-genica-multiple-aplicado-al-estudio-de-los-mecanismos-antiproliferativos-sobre-celulas-de-cancer-de-colon-de-un-alimento-rico-en-compuestos-fenolicos","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/ciencias-de-la-nutricion\/analisis-de-expresion-genica-multiple-aplicado-al-estudio-de-los-mecanismos-antiproliferativos-sobre-celulas-de-cancer-de-colon-de-un-alimento-rico-en-compuestos-fenolicos\/","title":{"rendered":"An\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple aplicado al estudio de los mecanismos antiproliferativos sobre c\u00e9lulas de c\u00e1ncer de colon de un alimento rico en compuestos fen\u00f3licos"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Mar\u00eda  Jose Bermudez Soto <\/strong><\/h2>\n<p>En los \u00faltimos a\u00f1os se ha acumulado una gran cantidad de evidencias epidemiol\u00f3gicas y experimentales que indican que los compuestos fen\u00f3licos ingeridos con los alimentos de origen vegetal pueden, en parte, estar implicados en la posible prevenci\u00f3n y\/o retardo de la aparici\u00f3n de ciertas formas de c\u00e1ncer. Las propiedades anticancer\u00edgenas y antiproliferativas de muchos de estos compuestos han sido estudiadas en modelos representativos de diversos tipos de c\u00e1ncer tanto in vitro como in vivo. Entre estos estudios y desde un punto de vista nutricional, la investigaci\u00f3n sobre la prevenci\u00f3n o reducci\u00f3n de c\u00e1nceres del tracto digestivo reviste un especial inter\u00e9s, puesto que es en el lumen gastrointestinal donde pueden acumularse de forma importante estos compuestos y\/o sus derivados fisiol\u00f3gicos. A pesar de la gran cantidad de evidencias acumuladas, existe todav\u00eda un gran desconocimiento de los mecanismos moleculares por los cuales los compuestos fen\u00f3licos de la dieta ejercen posibles efectos beneficiosos frente al desarrollo de c\u00e1ncer. En la presente tesis doctoral, se ha investigado la actividad antiproliferativa de un producto alimentario caracterizado por una composici\u00f3n rica y variada en compuestos fen\u00f3licos. El objetivo principal era ahondar en el estudio de los posibles mecanismos moleculares por los que el efecto antiproliferativo tiene lugar. Para ello, se ha utilizado un modelo celular in vitro de c\u00e1ncer de colon humano representativo de uno de los tipos de c\u00e1ncer del tracto digestivo de mayor incidencia en la actualidad. A diferencia de trabajos anteriores, en esta tesis hemos considerado de inter\u00e9s y abordado los siguientes aspectos: i) estudiar los efectos antiproliferativos de un alimento rico en compuestos fen\u00f3licos y no de los compuestos individuales, puesto que es la mezcla de todos los compuestos la que, in vivo, debe llegar y acumularse en el tracto digestivo; ii) determinar los efectos que la digesti\u00f3n gastroduodenal puede ejercer sobre los compuestos fen\u00f3licos y consecuentemente si dichos compuestos pueden llegar o no como tales al resto del intestino; iii) estudiar el efecto antiproliferativo del alimento digerido sobre las c\u00e9lulas cancerosas de colon bajo condiciones experimentales adecuadas que simulen en lo posible la situaci\u00f3n in vivo (dosis y tiempos representativos de la situaci\u00f3n fisiol\u00f3gica); iv) investigar los mecanismos moleculares de respuesta celular mediante t\u00e9cnicas de an\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple para lo cual hemos desarrollado y aplicado t\u00e9cnicas de micro- y macroarrays, que nos permiten estudiar simult\u00e1neamente de cientos a miles de genes. en la primera parte del trabajo se procedi\u00f3 a seleccionar un producto alimentario rico en compuestos fen\u00f3licos, que nos sirviera como producto modelo para el estudio. Para ello, obtuvimos y caracterizamos una serie de concentrados comerciales de frutos rojos de origen industrial, utilizados normalmente en la fabricaci\u00f3n de zumos y de inter\u00e9s por su posible aplicaci\u00f3n en la elaboraci\u00f3n de nuevos alimentos funcionales. Todos los concentrados estudiados constituyen una fuente importante de compuestos fen\u00f3licos, principalmente antocianos, procianidinas, flavonoles y derivados de hidroxicin\u00e1micos. Mediante ensayos in vitro, tambi\u00e9n se determin\u00f3 la capacidad antioxidante de estos concentrados ya que los compuestos fen\u00f3licos mencionados ejercen una importante actividad antirradical que, en parte, ha sido asociada a la protecci\u00f3n frente a la aparici\u00f3n de enfermedades degenerativas como el c\u00e1ncer. De entre los productos analizados, el concentrado de zumo de aronia presenta una mayor concentraci\u00f3n de compuestos fen\u00f3licos, adem\u00e1s de una alta capacidad antioxidante. Desde el punto de vista de la industria alimentaria, este concentrado podr\u00eda ser interesante como ingrediente para la fabricaci\u00f3n de zumos funcionales, es decir, zumos que, consumidos como parte de la dieta normal del individuo, ofrezcan beneficios para la salud y reduzcan el riesgo de sufrir enfermedades. Sin embargo, para llegar a obtener productos comerciales adecuados no podemos basarnos s\u00f3lo en su composici\u00f3n inicial en compuestos bioactivos, o en las propiedades antioxidantes in vitro, sino que es indispensable ahondar en la investigaci\u00f3n de las propiedades beneficiosas espec\u00edficas de estos productos y demostrar sus funciones in vivo. una buena parte de los estudios cient\u00edficos sobre los efectos beneficiosos de los compuestos fen\u00f3licos, han investigado estos compuestos de forma individual, aislados del resto de un alimento complejo, y, por lo general, a concentraciones muy altas que permiten observar o medir claramente los efectos (dosis efectivas, aunque no nutricionales). Estas condiciones, sin embargo, no se corresponden con las que se producir\u00edan en el organismo en condiciones fisiol\u00f3gicas normales a partir de la ingesta con la dieta (dosis nutricionales m\u00e1s bajas y repetitivas). Adem\u00e1s, en el organismo vivo habr\u00eda que tener en cuenta otros aspectos tales como el proceso de la digesti\u00f3n gastrointestinal, que puede producir alteraciones importantes en la estructura molecular de los compuestos ingeridos y modificar decisivamente sus propiedades iniciales. Se ha demostrado que los compuestos fen\u00f3licos de la dieta presentan una baja biodisponibilidad y, por tanto, es previsible que tras el consumo regular de alimentos ricos en compuestos fen\u00f3licos, en el tracto intestinal y en particular en el colon, se podr\u00eda acumular una cantidad relevante de una mezcla compleja de compuestos fen\u00f3licos y sus derivados formados durante la digesti\u00f3n. en esta l\u00ednea, en la segunda parte de esta tesis doctoral nos propusimos determinar mediante pruebas in vitro los efectos de la digesti\u00f3n gastrointestinal sobre la composici\u00f3n y estabilidad de los compuestos fen\u00f3licos presentes en el zumo de aronia. Los resultados obtenidos indican que estos compuestos fen\u00f3licos son bastante estables en las condiciones \u00e1cidas de la digesti\u00f3n g\u00e1strica pero que, una vez pasan al duodeno, donde las condiciones qu\u00edmicas son alcalinas, comienzan a sufrir alteraciones importantes de degradaci\u00f3n o de transformaci\u00f3n. Aunque en este trabajo no hemos identificado exactamente los compuestos formados, es de suponer que es la mezcla de compuestos iniciales junto con estos derivados la que, en principio, avanzar\u00eda hacia el colon y all\u00ed podr\u00eda ejercer efectos m\u00faltiples sobre la mucosa epitelial. en la siguiente parte de esta tesis doctoral se realiz\u00f3 el estudio de los efectos del zumo de aronia digerido sobre el modelo celular de c\u00e1ncer de colon humano (c\u00e9lulas caco-2). El ensayo se dise\u00f1\u00f3 de manera que las c\u00e9lulas fueran expuestas a cantidades del digerido de zumo equivalentes a cantidades totales de compuestos fen\u00f3licos representativas de las que podr\u00edan encontrarse en el colon tras la ingesta del zumo de aronia como parte de la dieta. Adem\u00e1s, para simular un consumo regular de este producto, se eligi\u00f3 tratar a las c\u00e9lulas de forma reiterada durante 4 d\u00edas. Tambi\u00e9n se consider\u00f3 importante reducir los per\u00edodos de tratamiento a 2 horas para que no se degradaran los compuestos fen\u00f3licos en el medio de cultivo. En paralelo, se tuvo tambi\u00e9n en cuenta que las dosis aplicadas a las c\u00e9lulas no produjeran efectos t\u00f3xicos letales por modificaci\u00f3n extrema en el ph y la osmolalidad del medio de cultivo, circunstancias que enmascarar\u00edan un efecto anti-proliferatvio real. los resultados de los tratamientos indicaron que el zumo de aronia digerido induce una importante inhibici\u00f3n de la proliferaci\u00f3n y un bloqueo del ciclo celular en la fase g2\/m en las c\u00e9lulas de c\u00e1ncer de colon a las dosis y tiempos estudiados. El siguiente paso fue entonces intentar establecer los posibles mecanismos moleculares por los cuales el tratamiento aplicado induc\u00eda esta respuesta en las c\u00e9lulas de c\u00e1ncer de colon. Para ello se aplicaron t\u00e9cnicas de an\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple (micro- y macroarrays), que nos permiten medir las diferencias en los niveles de expresi\u00f3n de miles o cientos de genes entre las c\u00e9lulas tratadas y las c\u00e9lulas no tratadas. A partir de estos grupos de genes diferenciados, intentamos seleccionar algunos genes de inter\u00e9s en relaci\u00f3n con el proceso antiproliferativo observado y establecer algunos de los mecanismos moleculares puestos en marcha en las c\u00e9lulas como respuesta al tratamiento. Nuestros resultados evidenciaron una serie de cambios en los niveles de expresi\u00f3n de grupos de genes involucrados en varios procesos biol\u00f3gicos tales como: transducci\u00f3n de se\u00f1ales, proliferaci\u00f3n celular, transcripci\u00f3n, apoptosis, adhesi\u00f3n celular y metabolismo. Entre los genes modificados por el tratamiento, detectamos la sobre-expresi\u00f3n de ceacam1 tanto a nivel g\u00e9nico como proteico. Se trata de un gen supresor de tumores, que juega un importante papel regulador en la proliferaci\u00f3n celular y cuya expresi\u00f3n est\u00e1 reducida en m\u00e1s de un 85% de los adenomas y carcinomas colorrectales en las etapas iniciales de desarrollo. Este gen podr\u00eda constituir un gen marcador de inter\u00e9s en relaci\u00f3n con los efectos antiproliferativos ejercidos por los compuestos fen\u00f3licos. Si los niveles de ceacam1 est\u00e1n reducidos en una alta proporci\u00f3n de lesiones hiperpl\u00e1sicas, previas a las lesiones neopl\u00e1sicas, la regulaci\u00f3n e inducci\u00f3n de esta prote\u00edna en c\u00e9lulas pre-malignas podr\u00eda estar asociada a efectos reductores de proliferaci\u00f3n y, por tanto, protectores frente al progreso de la malignidad. Nuestros estudios tambi\u00e9n detectaron otros genes que responden al tratamiento y que podr\u00edan estar implicados en los mecanismos moleculares subyacentes a la inhibici\u00f3n de la proliferaci\u00f3n y el bloqueo del ciclo celular observado en las c\u00e9lulas tratadas. Es el caso de varios genes que codifican diversas kinasas y fosfatasas, involucradas en rutas de se\u00f1alizaci\u00f3n mitog\u00e9nicas, que culminan con la regulaci\u00f3n de la proliferaci\u00f3n y del ciclo celular y que son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis celular y para evitar la aparici\u00f3n y el desarrollo del c\u00e1ncer. Entre estos genes destacan las fosfatasas dusp6, dusp1, ptpn11 y ptpn12 y el mediador de se\u00f1alizaci\u00f3n src. Otros genes, tambi\u00e9n modulados por el tratamiento, est\u00e1n directamente implicados en la regulaci\u00f3n y control de las distintas fases del ciclo celular e incluyen: el supresor tumoral tp53, cdkn1a (p21), sfn (14-3-3?), Gadd45, rad51, birc5, las ciclinas ccnf y ccnd2, y la ubiquitina c. En esta tesis se incluye un diagrama que recoge el flujo de uni\u00f3n de todas estas prote\u00ednas y que constituye la hip\u00f3tesis molecular de, al menos, uno de los mecanismos puestos en marcha en las c\u00e9lulas estudiadas en respuesta al tratamiento con el zumo de aronia. los resultados presentados en esta tesis contribuyen a la investigaci\u00f3n sobre los posibles mecanismos moleculares antiproliferativos, atribuidos a los alimentos ricos en compuestos fen\u00f3licos, sobre un modelo de c\u00e1ncer de colon. Nuestros resultados sugieren que el consumo de ciertos alimentos ricos en compuestos fen\u00f3licos podr\u00eda ejercer, a nivel del epitelio col\u00f3nico, efectos moduladores sobre los niveles de grupos de genes y prote\u00ednas implicados en se\u00f1alizaci\u00f3n mitog\u00e9nica y control de la proliferaci\u00f3n y ciclo celular. Esta regulaci\u00f3n se podr\u00eda traducir en el control del estado proliferativo de las c\u00e9lulas epiteliales que, a su vez, evitar\u00eda la propagaci\u00f3n de lesiones pre-malignas tempranas que desembocar\u00edan en la aparici\u00f3n de c\u00e1ncer. \tdurante el desarrollo de esta tesis se han puesto a punto y aplicado t\u00e9cnicas de an\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple: micro- y macroarrays. Los arrays de cdna son herramientas novedosas y \u00fatiles para el an\u00e1lisis de los cambios a nivel molecular ocasionados por un est\u00edmulo externo y que pueden proporcionar mucha informaci\u00f3n sobre los mecanismos celulares puestos en marcha. No obstante, hay que tener presente que esta metodolog\u00eda es relativamente reciente y a\u00fan presenta ciertas dificultades de an\u00e1lisis e interpretaci\u00f3n dada la enormidad y complejidad de los resultados que se obtienen. Como hemos podido observar en nuestros estudios, sobre todo en los realizados con los macroarrays, estas t\u00e9cnicas presentan una gran variabilidad inter- e intra- muestral. Para conseguir resultados reproducibles, es necesario desarrollar un dise\u00f1o experimental robusto que, en general, implica incrementar el n\u00famero de r\u00e9plicas tanto biol\u00f3gicas como tecnol\u00f3gicas (en este caso depende del tipo de array) y realizar un estudio estad\u00edstico apropiado. Todo esto conlleva el encarecimiento de los ensayos. En lo que se refiere al an\u00e1lisis de los datos, hay que establecer una serie de criterios para analizar los resultados. El denominado valor cut-off, que marca la diferencia entre lo que se considera cambio y no cambio de expresi\u00f3n, es un valor que puede ser m\u00e1s o menos arbitrario y ciertamente subjetivo, del cual depender\u00e1 la selecci\u00f3n final de genes que son aceptados como diferenciados entre las dos condiciones comparadas (por ejemplo, tratado vs. Control, enfermo vs. Sano, etc). Una vez que se obtienen los resultados, es importante y \u00fatil llevar a cabo estudios de interpretaci\u00f3n biol\u00f3gica que suele hacerse con la ayuda de herramientas bioinform\u00e1ticas. Esta parte tambi\u00e9n puede verse afectada por la herramienta empleda o, incluso, por el sesgo personal del investigador. Todos estos aspectos tendr\u00e1n un gran efecto sobre los resultados de los an\u00e1lisis con microarrays. en general, los resultados de microarrays necesitan muchos ensayos posteriores de confirmaci\u00f3n con otras t\u00e9cnicas moleculares, como las t\u00e9cnicas de rt-pcr a tiempo real. Adem\u00e1s, los cambios en los niveles de arnm no siempre se correlacionan con cambios paralelos en las prote\u00ednas y\/o metabolitos. Para comprender la relevancia biol\u00f3gica de los cambios detectados a nivel g\u00e9nico, los estudios deber\u00e1n complementarse mediante la confirmaci\u00f3n a nivel proteico, e incluso metab\u00f3lico, de los cambios observados. la continuaci\u00f3n del estudio presentado en esta tesis implica pues la validaci\u00f3n del mecanismo propuesto mediante ensayos que confirmen los cambios a nivel de prote\u00edna. Una vez confirmado el mecanismo, proponemos que ser\u00eda de gran inter\u00e9s investigar si \u00e9ste se verifica en otros modelos celulares de c\u00e1ncer de colon, as\u00ed como determinar la respuesta de modelos celulares de colon no cancerosos frente al tratamiento con el zumo de aronia, para establecer as\u00ed la especificidad de la respuesta celular. \ta medio-largo plazo, los avances en el conocimiento del genoma humano y su biolog\u00eda, junto con la reducci\u00f3n en los costes de esta tecnolog\u00eda, har\u00e1n de las t\u00e9cnicas de an\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple unas herramientas muy prometedoras para el estudio de aquellos mecanismos moleculares responsables del inicio y desarrollo de enfermedades tan importantes para nuestra sociedad como el c\u00e1ncer y otras enfermedades degenerativas.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>An\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple aplicado al estudio de los mecanismos antiproliferativos sobre c\u00e9lulas de c\u00e1ncer de colon de un alimento rico en compuestos fen\u00f3licos<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 An\u00e1lisis de expresi\u00f3n g\u00e9nica m\u00faltiple aplicado al estudio de los mecanismos antiproliferativos sobre c\u00e9lulas de c\u00e1ncer de colon de un alimento rico en compuestos fen\u00f3licos <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Mar\u00eda  Jose Bermudez Soto <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Murcia<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 19\/12\/2008<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Francisco Abraham Tomas Barberan<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: isabel Tovar zapata <\/li>\n<li>pablo Conesa zamora (vocal)<\/li>\n<li>Jes\u00fas Garc\u00eda cantalejo (vocal)<\/li>\n<li>daniel Ram\u00f3n vidal (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Mar\u00eda Jose Bermudez Soto En los \u00faltimos a\u00f1os se ha acumulado una gran cantidad de evidencias epidemiol\u00f3gicas 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