{"id":91523,"date":"2009-05-02T00:00:00","date_gmt":"2009-05-02T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/desarrollo-de-un-metodo-inmunoquimico-para-la-deteccion-y-cuantificacion-de-esporos-de-clostridium-tyrobutyricum-en-leche\/"},"modified":"2009-05-02T00:00:00","modified_gmt":"2009-05-02T00:00:00","slug":"desarrollo-de-un-metodo-inmunoquimico-para-la-deteccion-y-cuantificacion-de-esporos-de-clostridium-tyrobutyricum-en-leche","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/tecnologia-de-los-alimentos\/desarrollo-de-un-metodo-inmunoquimico-para-la-deteccion-y-cuantificacion-de-esporos-de-clostridium-tyrobutyricum-en-leche\/","title":{"rendered":"Desarrollo de un metodo inmunoquimico para la deteccion y cuantificacion de esporos de clostridium tyrobutyricum en leche"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Mar\u00eda Lavilla Martin <\/strong><\/h2>\n<p>La fermentaci\u00f3n but\u00edrica es un grave problema en la fabricaci\u00f3n de queso, que se manifiesta a lo largo de la maduraci\u00f3n y provoca un defecto conocido como la \u00abhinchaz\u00f3n tard\u00eda\u00bb, y que provoca importantes p\u00e9rdidas econ\u00f3micas en la industria quesera. El principal agente responsable de la fermentaci\u00f3n but\u00edrica es clostridium tyrobutyricum. la velocidad de aparici\u00f3n de la hinchaz\u00f3n tard\u00eda, as\u00ed como la proporci\u00f3n de quesos afectados, est\u00e1 estrechamente ligada al n\u00famero ,de esporos de este microorganismo, presentes inicialmente en la leche. Actualmente, el m\u00e9todo de detecci\u00f3n de referencia es el m\u00e9todo del n\u00famero m\u00e1s probable, pero es un m\u00e9todo laborioso, inespec\u00edfico y lento. Por ello, ser\u00eda \u00fatil disponer de un m\u00e9todo para la detecci\u00f3n de los esporos en la leche, antes de destinarla a la elaboraci\u00f3n del queso, dado que la presencia de esporos de clostridium tyrobutyricum no produce problemas en otros productos l\u00e1cteos. en esta tesis, se han obtenido antisueros anti-esporos de clostridium tyrobutyricum de especificidad elevada mediante la inoculaci\u00f3n de esporos completos tanto en conejos como en ovejas. En esta etapa, se estudi\u00f3 el efecto de diversos tratamientos de los esporos en s\u00ed\u00bc inmunogenicidad, observando que el tratamiento por calor aplicado a los esporos de clostridium tyrobutyricum favorece la respuesta inmune, principalmente en las primeras inmunizaciones. Una vez obtenidos los antisueros, los anticuerpos espec\u00edficos se aislaron mediante inmunoadsorci\u00f3n para su posterior aplicaci\u00f3n en la detecci\u00f3n de los esporos. Tambi\u00e9n se ha caracterizado la prote\u00edna de los esporos de clostridium tyrobutyricum, mayoritariamente reconocida por los anticuerpos. Esta prote\u00edna, se encuentra tanto en las formas vegetativas como en los esporos, y tiene alta homolog\u00eda de secuencia con algunas prote\u00ednas de la familia de las chaperonas del g\u00e9nero clostridium. adem\u00e1s de los anticuerpos, se han obtenido trece ligandos pept\u00eddicos espec\u00edficos y afines por los esporos de clostridium tyrobutyricum a partir de una biblioteca de p\u00e9ptidos expresados en fagos (phage display). El p\u00e9ptido que hemos denominado pcts1, es, de los trece p\u00e9ptidos, es el m\u00e1s af\u00edn por los esporos. Este p\u00e9ptido fue sintetizado para su posterior aplicaci\u00f3n en la separaci\u00f3n y detecci\u00f3n de los esporos. una vez obtenidos los ligandos espec\u00edficos para los esporos de clostridium tyrobutyricum, se ha desarrollado un m\u00e9todo de separaci\u00f3n biomagn\u00e9tica de los esporos en suspensi\u00f3n, tapizando esferas superparamagn\u00e9ticas con dichos ligandos. Se ha comprobado que tanto los anticuerpos como los p\u00e9ptidos, son apropiados para la separaci\u00f3n de los esporos de clostridium tyrobutyricum a partir 4e una suspensi\u00f3n acuosa. Sin embargo, el tama\u00f1o de las esferas paramagn\u00e9ticas, tapizadas con anticuerpos espec\u00edficos anti-esporos, influye en la capacidad de separaci\u00f3n de \u00e9stos, siendo las de 200 nm de di\u00e1metro las m\u00e1s efectivas, con las que se recuperaron un porcentaje de esporos por encima del 90%. Adem\u00e1s, es importante la orientaci\u00f3n final de los anticuerpos en las esferas para obtener una \u00f3ptima separaci\u00f3n de los esporos. En este caso, el tapizado covalente de las esferas derivatizadas con grupos amino a trav\u00e9s de los carbohidratos de la regi\u00f3n fc de las inmunoglobulinas, fue el m\u00e9todo m\u00e1s apropiado. Las esferas tapizadas con el p\u00e9ptido pcts 1 tambi\u00e9n fueron muy efectivas en la separaci\u00f3n de los esporos de clostridium tyrobutyricum, obteniendose de nuevo porcentajes de recuperaci\u00f3n de esporos por encima del 90%. La mayor estabilidad del ligando pept\u00eddico, m\u00e1s resistente a cambios de orientaci\u00f3n en la superficie de las esferas, lo hace m\u00e1s adecuado que los anticuerpos para su utilizaci\u00f3n en la separaci\u00f3n biomagn\u00e9tica. Adem\u00e1s, utilizando el p\u00e9ptido pcts 1 biotinilado como marcador, este m\u00e9todo permite detectar los esporos de clostridium tyrobutyricum separados con las esferas paramagn\u00e9ticas desde una concentraci\u00f3n de 1000 esporos\/ml en una suspensi\u00f3n acuosa. adem\u00e1s de la separaci\u00f3n biomagn\u00e9tica se ha desarrollado un m\u00e9todo de detecci\u00f3n de los esporos por citometr\u00eda de flujo. Se han establecido los par\u00e1metros de dispersi\u00f3n de luz y fluorescencia para la detecci\u00f3n de los esporos de clostridium tyrobutyricum, mediante la utilizaci\u00f3n de anticuerpos conjugados con fluoresce\u00edna o alexa fluor 488. Estos par\u00e1metros permiten, adem\u00e1s de la detecci\u00f3n de los esporos de clostridium tyrobutyricum, su diferenciaci\u00f3n de los esporos de otros microorganismos del mismo g\u00e9nero. De los dos fluorocromos estudiados, el fluorocromo alexa fluor 488 fue el mejor marcador para la detecci\u00f3n mediante citometr\u00eda de flujo, dado que permite mayores restricciones en la intensidad de fluorescencia. Este m\u00e9todo citom\u00e9trico, tras la aplicaci\u00f3n de un tratamiento preliminar de una muestra de leche, y la concentraci\u00f3n de los esporos por centrifugaci\u00f3n, permite detectar desde 1000 esporos en 100 ml de leche en un tiempo total inferior a 2 horas.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Desarrollo de un metodo inmunoquimico para la deteccion y cuantificacion de esporos de clostridium tyrobutyricum en leche<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Desarrollo de un metodo inmunoquimico para la deteccion y cuantificacion de esporos de clostridium tyrobutyricum en leche <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Mar\u00eda Lavilla Martin <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Zaragoza<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 05\/02\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Mar\u00eda  Lourdes Sanchez Paniagua<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Santiago Condon uson <\/li>\n<li>vicente Sanchis almenar (vocal)<\/li>\n<li>Mar\u00eda  dolores Guillen loren (vocal)<\/li>\n<li>teresa Garcia lacarra (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Mar\u00eda Lavilla Martin La fermentaci\u00f3n but\u00edrica es un grave problema en la fabricaci\u00f3n de queso, que se 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