{"id":91790,"date":"2018-03-11T10:10:39","date_gmt":"2018-03-11T10:10:39","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/caracterizacion-redox-de-apoptosis-inducing-factor-y-estudio-de-los-mecanismos-moleculares-implicados-en-su-transferencia-electronica\/"},"modified":"2018-03-11T10:10:39","modified_gmt":"2018-03-11T10:10:39","slug":"caracterizacion-redox-de-apoptosis-inducing-factor-y-estudio-de-los-mecanismos-moleculares-implicados-en-su-transferencia-electronica","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/genetica-bioquimica\/caracterizacion-redox-de-apoptosis-inducing-factor-y-estudio-de-los-mecanismos-moleculares-implicados-en-su-transferencia-electronica\/","title":{"rendered":"Caracterizacion redox de \u00abapoptosis inducing factor\u00bb y estudio de los mecanismos moleculares implicados en su transferencia electronica"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Mar\u00eda  Dolores Miramar Gallart <\/strong><\/h2>\n<p>Apoptosis inducing factor (aif) es una flavoprote\u00edna con gran homolog\u00eda estructural respecto a prote\u00ednas ferredoxina reductasas nadh dependientes acopladas a oxigenasa (onfrs), localizada en la membrana interna mitocondrial que ante un est\u00edmulo apopt\u00f3tico sale de la mitocondria y se transloca al n\u00facleo donde induce condensaci\u00f3n de la cromatina y fragmentaci\u00f3n de alto peso molecular de aproximadamente 50 kb. Representa una v\u00eda apopt\u00f3tica mitocondrial independiente de caspasas, ya que la inhibici\u00f3n de \u00e9stas no afecta su actividad. Desde que se descubriera en 1999, ha sido objeto de una intensa investigaci\u00f3n cient\u00edfica en el campo de la apoptosis y tambi\u00e9n se han publicado numerosos estudios que la relacionan con la embriog\u00e9nesis, el estr\u00e9s oxidativo, la fosforilaci\u00f3n oxidativa -en relaci\u00f3n con el mantenimiento, biog\u00e9nesis o ensamblaje del complejo i-, el mantenimiento del estado transformado de las c\u00e9lulas tumorales de colon y el metabolismo celular. Los objetivos de esta tesis doctoral han sido: 1) estudiar las propiedades redox de la flavoprote\u00edna apoptosis inducing factor (aif) y realizar un estudio bioqu\u00edmico de la prote\u00edna y determinar sus actividades; 2) determinar la relaci\u00f3n de sus propiedades redox con su actividad apoptog\u00e9nica y 3) analizar los mecanismos moleculares implicados en la transferencia electr\u00f3nica de la prote\u00edna mediante la caracterizaci\u00f3n de mutantes. Los resultados obtenidos se detallan a continuaci\u00f3n. Aifdelta1-120 de rat\u00f3n (maif; q9z0x1) es una flavoprote\u00edna que presenta un \u00fanico grupo prost\u00e9tico, fad, unido de forma no covalente y con una relaci\u00f3n molar 1:1. Se analiz\u00f3 mediante espectroscop\u00eda de masas por plasma de inducci\u00f3n acoplado el contenido de metales sin encontrarse cantidades significativas de ninguno. Se determin\u00f3 mediante cromatograf\u00eda de filtraci\u00f3n en gel y espectroscop\u00eda de masas una masa molecular de 57 kda (masa molecular teorica 57046), por lo que a concentraci\u00f3n salina cercana a la fisiol\u00f3gica se encuentra en forma monom\u00e9rica. Mediante derivatizaci\u00f3n con el reactivo de ellman se comprob\u00f3 que presenta tres grupos tiol accesibles por mol\u00e9cula que no forman puentes disulfuro y a trav\u00e9s del ensayo nadh-dtnb oxidoreductasa se estudi\u00f3 el posible papel de las ciste\u00ednas como centros redox. Estas ciste\u00ednas no parecen estar implicadas en transporte redox a diferencia de los enzimas de la familia de la glutation reductasa (gr). Maifdelta1-120, maifdelta 1-101 y aifdelta1-102 humana (haif; o95831-1) muestran las caracter\u00edsticas espectrosc\u00f3picas de una flavoprote\u00edna con fad, con m\u00e1ximos en el visible a 378 nm y 450 nm y un hombro a 467 nm. El coeficiente de extinci\u00f3n para maifdelta1-120 es 12.12 mm-1cm-1 y para haifdelta1-102 es 15.37 mm-1cm-1. Maifdelta1-120 une nadh y nadph que, en cantidades equimoleculares, producen la reacci\u00f3n completa de la flavoprote\u00edna, sin formaci\u00f3n del intermediario semiquinona. Se generan dos complejos de transferencia de carga muy estables con m\u00e1ximos a 637 y 774 nm para el nadh y 740 y 779 nm para nadph. El potencial redox de maifdelta1-120 est\u00e1 fuertemente influenciado por el ph. Maifdelta1-120 presenta valores de potencial redox  -264 +\/- 12mv a ph 6.5,  -308 +\/- 15mv a ph 7.5 y -373 +\/- 15mv a ph 9, asumiendo una transferencia en un paso de dos electrones. La desviaci\u00f3n de los valores te\u00f3ricos para este tipo de transferencia indica la posible presencia de otros grupos disociables cuyos valores de pka son dependientes del estado redox del enzima.  Haifdelta1-102 presenta dos potenciales redox correspondientes a dos transferencias de un electr\u00f3n consecutivas: -326 y -360mv +\/- 10mv a ph 7.5 y 20\u00c2\u00bac. Maifdelta1-120 presenta actividad diaforasa con aceptores de un electr\u00f3n y de dos electrones. Maifdelta1-120 tiene actividades nadh oxidasa, monodehidroascorbato reductasa, citocromo c reductasa y adrenodoxina reductasa. Maifdelta1-120 reducida puede generar ani\u00f3n super\u00f3xido en condiciones aer\u00f3bicas y esta actividad podr\u00eda contribuir al incremento de radicales libres de ox\u00edgeno tras su salida de la mitocondria. Se ha estudiado la actividad redox \u00abin vivo\u00bb en mitocondrias aisladas de hepatocitos de rat\u00f3n y se ha demostrado que aif nativa mitocondrial  posee una actividad nadh oxidasa\/nbt reductasa igual a la prote\u00edna recombinante. Por otra parte se ha analizado la relaci\u00f3n entre la actividad apoptog\u00e9nica de aif y su actividad redox. La presencia de nadh o nadph, que puede inducir un cambio conformacional en maifdelta1-120, no influye sobre la capacidad apoptog\u00e9nica de la prote\u00edna, y  la apoprote\u00edna de maifdelta1-120 y maifdelta1-101 presenta la misma capacidad apoptog\u00e9nica que la holoprote\u00edna. Adem\u00e1s,  la prote\u00edna de choque t\u00e9rmico hsp70, que inhibe la capacidad apoptog\u00e9nica de aif, no afecta a la capacidad redox de maifdelta1-120. Por tanto se concluy\u00f3 que la actividad redox de maifdelta1-120 y maifdelta1-101 es independiente de su actividad apoptog\u00e9nica. Finalmente se analizaron los mecanismos moleculares implicados en la transferencia electr\u00f3nica de aif humana. Para ello se obtuvieron prote\u00ednas recombinantes con mutaciones en residuos del centro activo de la prote\u00edna (pdb 1m6i) mediante clonaci\u00f3n del cdna en el vector de expresi\u00f3n pet28a y purificaci\u00f3n por cromatograf\u00eda de afinidad a metales. Mediante cin\u00e9ticas r\u00e1pidas con flujo detenido (stopped-flow) se demostr\u00f3 que los mutantes k177w, e314s, f310g, p173g y w483g, as\u00ed como el mutante doble k177w\/e314s est\u00e1n considerablemente ralentizados en su reducci\u00f3n con nadh  (k1 ajustada tanto para procesos bif\u00e1sicos como monof\u00e1sicos entre 0.06 y 1.4 s-1) respecto a la prote\u00edna salvaje haifdelta 1-102 (kobs>600 s-1) y adem\u00e1s la amplitud de la reacci\u00f3n es muy escasa. Por tanto los residuos k177, e314, f310, p173 y w483 est\u00e1n implicados en la transferencia electr\u00f3nica de haifdelta1-102. Tambi\u00e9n se estudi\u00f3 la reacci\u00f3n de formaci\u00f3n de los compejos de transferencia de carga ct1 a 600 nm y ct2 a 720 nm. Se determinaron los potenciales redox para los mutantes de haif f310g y w483g. El residuo f310 modula el potencial redox de la flavina. Su cambio por glicina produce un dram\u00e1tico efecto sobre el potencial redox de aif humana (e0\u00c2\u00bf= -20 mv, aproximadamente). El potencial redox del mutante w483g result\u00f3 -292 mv a ph 7.5 y 20\u00c2\u00bac. Se ha propuesto un modelo de reducci\u00f3n de aif con nadh con la formaci\u00f3n de cuatro especies intermedias, dos de ellas complejos de transferencia de carga. Mediante modelado computacional se proponen dos modelos de interacci\u00f3n de haif con nad+, seg\u00fan la estructura cristalina del complejo fnr:nad+ (c\u00f3digo pdb: 2bsa) y seg\u00fan la estructura cristalina del complejo bpha4:nad+ (c\u00f3digo pdb: 2yvj) y gr:nad+ (c\u00f3digo pdb: 1get). En ambos modelos la distancia entre las posiciones c4 de la nicotinamida y el n5 de la isoaloxazina permitir\u00eda una transferencia de hidruro eficaz.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Caracterizacion redox de \u00abapoptosis inducing factor\u00bb y estudio de los mecanismos moleculares implicados en su transferencia electronica<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Caracterizacion redox de \u00abapoptosis inducing factor\u00bb y estudio de los mecanismos moleculares implicados en su transferencia electronica <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Mar\u00eda  Dolores Miramar Gallart <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Zaragoza<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 20\/02\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Santos Susin Lopez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: angel Garcia de jalon comet <\/li>\n<li>milagros Medina trullenque (vocal)<\/li>\n<li>hans kristian Lorenzo gracia (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Mar\u00eda Dolores Miramar Gallart Apoptosis inducing factor (aif) es una flavoprote\u00edna con gran homolog\u00eda estructural respecto a 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