{"id":91929,"date":"2018-03-11T10:10:48","date_gmt":"2018-03-11T10:10:48","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/purificacion-y-caracterizacion-de-una-isoforma-calcio-dependiente-de-protea%c2%adna-quinasa-c-en-mytilus-galloprovincialis-lmk\/"},"modified":"2018-03-11T10:10:48","modified_gmt":"2018-03-11T10:10:48","slug":"purificacion-y-caracterizacion-de-una-isoforma-calcio-dependiente-de-protea%c2%adna-quinasa-c-en-mytilus-galloprovincialis-lmk","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/enzimologia\/purificacion-y-caracterizacion-de-una-isoforma-calcio-dependiente-de-protea%c2%adna-quinasa-c-en-mytilus-galloprovincialis-lmk\/","title":{"rendered":"Purificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de una isoforma calcio dependiente de prote\u00edna quinasa c en mytilus galloprovincialis lmk."},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Mart\u00edn Gonz\u00e1lez Riopedre <\/strong><\/h2>\n<p>Introducci\u00f3n las quinasas \tlas quinasas son enzimas fosforilantes que catalizan la adici\u00f3n de un grupo fosfato procedente de atp u otro nucle\u00f3sido trifosfato al grupo hidroxilo de un amino\u00e1cido de la prote\u00edna sustrato, generando la formaci\u00f3n de un enlace fosfo\u00e9ster. pueden actuar sobre gl\u00facidos, l\u00edpidos o prote\u00ednas. Si act\u00faan sobre prote\u00ednas podemos distinguir dos tipos de prote\u00ednas quinasas: pks de serina &#8211; treonina que fosforilan residuos serinas o treoninas (como la pka o la pkc), y pks de tirosina que act\u00faan sobre residuos tirosina como la familia de las src quinasas. prote\u00edna quinasa c existen numerosas referencias en la bibliograf\u00eda otorgando a esta prote\u00edna un papel central en la transducci\u00f3n de se\u00f1ales en la c\u00e9lula. As\u00ed, se ha implicado a la pkc en la regulaci\u00f3n del crecimiento y diferenciaci\u00f3n celular, desarrollo neural, transmisi\u00f3n sin\u00e1ptica, regeneraci\u00f3n axonal, contracci\u00f3n y relajaci\u00f3n del m\u00fasculo liso, secreci\u00f3n endocrina y exocrina, desarrollo de tumores, apoptosis y envejecimiento. Se pensaba que la pkc resid\u00eda en el citoplasma en una conformaci\u00f3n inactiva y que se translocaba a la membrana plasm\u00e1tica o a los org\u00e1nulos citoplasm\u00e1ticos debido a la activaci\u00f3n celular por diferentes est\u00edmulos. Sin embargo, las evidencias recogidas durante los \u00faltimos 20 a\u00f1os han mostrado que la pkc es capaz de translocarse al n\u00facleo. \tse han descrito hasta el momento once isotipos de pkc diferentes, cada isotipo tiene un rol distinto. Las pkcs pueden clasificarse en tres grandes grupos: a)\tlas cl\u00e1sicas o dependientes de calcio (cpkcs): \u00c2\u00bf, \u00edYi, \u00edYii y \u00c2\u00bf. son sensibles al ca2+, dag y son activadas por \u00e9steres de forbol, cl\u00e1sicamente forbol 12 &#8211; miristato 13 &#8211; acetato (pma) y fosfatidilserina (ps). b)\tlas nuevas o independientes de calcio (npkcs): \u00c2\u00bf, \u00c2\u00bf, \u00c2\u00bf y \u00c2\u00bf.  son independientes de ca2+ (carecen de regi\u00f3n c2) pero son activadas por \u00e9steres de forbol, fosfatidil serina y diacilglicerol. c)\tlas at\u00edpicas, (apkcs): \u00c2\u00bf, \u00c2\u00bf, \u00c2\u00bf. estas son independientes de ca2+ (carecen de la regi\u00f3n c2) y no son sensibles a los \u00e9steres de forbol, dag y pma, son dependientes de ps y estos isotipos tienen tan solo una secuencia rica en cisteina en la regi\u00f3n c1. \tadicionalmente, pkc \u00c2\u00bf y \u00c2\u00bf son considerados por algunos una cuarta clase y para otros comprenden una familia distinta llamada prote\u00edna quinasa d. Todos los miembros tienen en com\u00fan un dominio catal\u00edtico conservado en la regi\u00f3n carboxilo terminal. La otra mitad de la quinasa, el dominio regulador presenta 2 partes clave: una secuencia autoinhibidora (pseudo-sustrato) y uno o dos m\u00f3dulos de uni\u00f3n a la membrana (dominios c1 y c2) y, en el caso de la prote\u00edna quinasa d, el dominio ph.   estructura de las pkcs \ttodas las isoformas de pkc est\u00e1n formadas por una cadena polipept\u00eddica,  en la que se detectan regiones conservadas (c1-c4) separadas por regiones variables (v1-v5). La regi\u00f3n carboxilo-terminal que comprende las regiones c3-v5, ha sido definida como el dominio catal\u00edtico, el cual est\u00e1 separado del dominio regulador amino-terminal por la regi\u00f3n v3. el dominio catal\u00edtico contiene secuencias consenso para la uni\u00f3n de atp (regi\u00f3n c3), la regi\u00f3n de transferencia del fosfato y el sitio de uni\u00f3n del sustrato (regi\u00f3n c4). el dominio regulador contiene varias regiones que permiten la interacci\u00f3n de la prote\u00edna con l\u00edpidos y los cofactores necesarios para su activaci\u00f3n. La regi\u00f3n v1 contiene una secuencia considerada como un pseudosustrato que es muy similar a secuencias de fosforilaci\u00f3n para pkcs, excepto porque el residuo diana de serina\/treonina est\u00e1 sustituido por un amino\u00e1cido no fosforilable, generalmente alanina.  distribuci\u00f3n tisular de la pkc se ha determinado mediante an\u00e1lisis por northern o western blot la distribuci\u00f3n de las isoenzimas pkc (esta distribuci\u00f3n aparece resumida en la tabla 1.1). Las pkc \u00c2\u00bf, \u00edYi, \u00edYii, \u00c2\u00bf, \u00c2\u00bf y \u00c2\u00bf parecen ser isoenzimas ubicuas que aparecen en la mayor\u00eda de los tejidos, mientras que la expresi\u00f3n de otras pkcs es en gran parte espec\u00edfica del tipo de c\u00e9lula. los tejidos est\u00e1n constituidos por distintos tipos celulares, por tanto, es importante determinar qu\u00e9 isoenzimas est\u00e1n presentes en cada uno de ellos. De igual forma, es interesante establecer el perfil de las isoformas en los cultivos celulares, puesto que pueden existir diferencias entre las c\u00e9lulas cultivadas y el tipo celular de procedencia. En general, las diferentes isoformas de pkc tienen patrones de distribuci\u00f3n espec\u00edficos en la c\u00e9lula, que reflejan los diferentes papeles de cada isoforma.    distribuci\u00f3n subcelular de la pkc las formas inactivas de la pkc se encuentran mayoritariamente en el citosol, mientras que sus activadores, de naturaleza hidrof\u00f3bica, est\u00e1n presentes en la membrana. \trecientemente, se han realizado estudios con t\u00e9cnicas de microscop\u00eda confocal, que revelan una localizaci\u00f3n m\u00e1s compleja y espec\u00edfica de las diferentes isoenzimas de la pkc. Estos estudios demuestran que en c\u00e9lulas que expresan varias isoformas, la mayor\u00eda de ellas se encuentran localizadas en estructuras subcelulares y, tras la activaci\u00f3n, mudan su localizaci\u00f3n a diferentes localizaciones en la c\u00e9lula. Las isoformas de pkc \u00c2\u00bf, \u00edY y \u00c2\u00bf se localizan principalmente en la fracci\u00f3n citos\u00f3lica de c\u00e9lulas no estimuladas y experimentan una translocaci\u00f3n a las membranas celulares de c\u00e9lulas activadas.  activaci\u00f3n de pkc para las cpkcs, el modelo de activaci\u00f3n intracelular, aceptado actualmente, ser\u00eda el siguiente: 1)\tla activaci\u00f3n de la plc gamma producir\u00eda la hidr\u00f3lisis de fosfatidilinositol 4,5 &#8211; bifosfato (pip2), asociado a la membrana, liber\u00e1ndose dag e ip3. 2)\tel ip3 producido provocar\u00eda la liberaci\u00f3n de calcio de reservas intracelulares no mitocondriales. 3)\tel calcio liberado se unir\u00eda a la regi\u00f3n c2 de la pkc produciendo la translocaci\u00f3n de la enzima a la membrana plasm\u00e1tica. 4)\tuna vez en la membrana plasm\u00e1tica, la pkc se unir\u00eda a trav\u00e9s de la regi\u00f3n c1 al dag, generado anteriormente y a ps, que est\u00e1 constitutivamente presente en la membrana, produci\u00e9ndose su activaci\u00f3n.  translocaci\u00f3n una particularidad importante en la activaci\u00f3n de pkc es la redistribuci\u00f3n intracelular de la enzima. La pkc ha sido localizada en la fracci\u00f3n citos\u00f3lica de las c\u00e9lulas y la activaci\u00f3n de esta quinasa est\u00e1 asociada a una redistribuci\u00f3n de la enzima desde el citosol hacia ambientes m\u00e1s hidrof\u00f3bicos como puede ser la membrana plasm\u00e1tica. La uni\u00f3n de ca2+ y dag a esta quinasa en presencia de fosfatidil l-serina (ps), provoca un cambio conformacional en la pkc, increment\u00e1ndose de esta forma, su hidrofobicidad. La din\u00e1mica del movimiento de la quinasa a la membrana plasm\u00e1tica, en respuesta a la activaci\u00f3n de receptores de superficie celular, ocurre en tres pasos: la translocaci\u00f3n a la membrana, el anclaje y la disociaci\u00f3n. Se sabe que estos procesos son regulados por autofosforilaciones, aunque la quinasa se fosforile en el citosol, necesita de varias fosforilaciones para alcanzar la membrana, a\u00fan en presencia de calcio. Las fosforilaciones inciden en el aumento de la afinidad por dag y ps. Finalmente, una vez cesada la estimulaci\u00f3n sobre el receptor de superficie, se produce la disociaci\u00f3n de la pkc, por un descenso de los niveles de dag y ca2+, que inducen una autofosforilaci\u00f3n de los dominios reguladores.  proteolisis de pkc la pkc fue descubierta como una prote\u00edna quinasa activada por proteasas, aunque posteriormente se vio que la proteolisis segu\u00eda a la activaci\u00f3n. Se piensa que las proteasas responsables, \u00abin vivo\u00bb, son las proteasas neutras dependientes de calcio (calpainas i y ii). La activaci\u00f3n proteol\u00edtica se puede realizar \u00abin vitro\u00bb mediante tratamiento limitado con tripsina aunque \u00abin vivo\u00bb se piensa que la activaci\u00f3n y translocaci\u00f3n a la membrana celular son requisitos previos a la proteolisis. No est\u00e1 claro si la degradaci\u00f3n proteol\u00edtica sirve como mecanismo para inactivar la quinasa o si el fragmento catal\u00edtico liberado de la membrana o del citosol (y posiblemente de otros compartimentos celulares), es capaz de actuar como una quinasa con actividad constitutiva independiente de activadores.   down regulation otro mecanismo importante dentro de los procesos de regulaci\u00f3n es la \u00abdown regulation\u00bb. Se denomina \u00abdown regulation\u00bb al fen\u00f3meno por el que se depleciona la pkc, por degradaci\u00f3n proteol\u00edtica, como consecuencia por ejemplo del tratamiento prolongado de determinados tipos celulares con \u00e9steres de forbol. Con respecto a la \u00abdown regulation\u00bb, las distintas isoenzimas de pkc muestran rasgos muy diferentes que est\u00e1n de acuerdo con los observados in vitro.  regulaci\u00f3n de la pkc la prote\u00edna quinasa c es regulada por dos mecanismos secuenciales e igualmente cr\u00edticos: fosforilaci\u00f3n provocada por la pdk-1, y uni\u00f3n a dag y\/o otros cofactores. Cada mecanismo regula la estructura, localizaci\u00f3n subcelular y funci\u00f3n de la pkc. las pkcs reci\u00e9n sintetizadas se asocian a un compartimento de membrana en la c\u00e9lula y en una conformaci\u00f3n \u00ababierta\u00bb en la que la secuencia auto-inhibitoria del pseudo-sustrato es expulsada del sitio activo del dominio catal\u00edtico. La pdk-1 se acopla al c-terminal expuesto y el sitio de la pdk-1 en la secuencia del asa de activaci\u00f3n queda accesible para su fosforilaci\u00f3n. Tras la fosforilaci\u00f3n de la secuencia del asa de activaci\u00f3n, pdk-1 es liberada del c-terminal de la pkc, y \u00e9ste queda expuesto para sufrir dos fosforilaciones r\u00e1pidas. En el caso de pkcs convencionales, esta fosforilaci\u00f3n ocurre por un mecanismo intramolecular de auto-fosforilaci\u00f3n. Las especies fosforiladas (maduras) son liberadas al citosol y el pseudosustrato puede acceder al sitio activo, manteniendo la enzima en un estado autoinhibido. La enzima es activada tras la generaci\u00f3n de calcio y diacilglicerol mediada por receptores. Estos ligandos reclutan la pkc de la membrana mediante la participaci\u00f3n de dos m\u00f3dulos de anclaje en la membrana, un suceso que proporciona la energ\u00eda necesaria para expulsar al pseudosustrato de la cavidad de uni\u00f3n del sustrato y permite la fosforilaci\u00f3n del sustrato.  prote\u00ednas de anclaje de las pkc las prote\u00ednas que interact\u00faan con isoformas espec\u00edficas de pkc para la localizaci\u00f3n en los compartimentos especializados de la c\u00e9lula son llamadas prote\u00ednas de anclaje (o de corte).  las prote\u00ednas de anclaje para las isoenzimas de la pkc activas se han denominado como receptores para quinasa c activas (rack). Rack1, que fue la primera prote\u00edna de anclaje en ser aislada para pkc \u00edYii revel\u00f3 la uni\u00f3n de varias isoformas de pkc inclusive pkc \u00c2\u00bf y pkc \u00c2\u00bf. mochly-rosen y gordon (1998) han propuesto la existencia de otro grupo de prote\u00ednas de anclaje para las formas inactivas de la pkc que han sido denominadas receptores para quinasa c inactivas (rick).  \t ricks se han identificado prote\u00ednas adicionales de uni\u00f3n a la pkc, todas ellas son sustrato de la pkc y unen directamente ps. La uni\u00f3n de ps es com\u00fan en este tipo de prote\u00ednas de uni\u00f3n, la cual parece actuar de puente entre la pkc y dichas prote\u00ednas. Entre \u00e9stas se incluyen la talina, la vinculina, sustrato de la quinasa c rico en alanina miristoilada (marck), akap79, y algunas otras. entre algunas de las caracter\u00edsticas predichas para estas rick se encuentran las siguientes: no necesariamente son sustratos de la pkc, deben demostrar preferencia de uni\u00f3n por formas inactivas de este enzima y, finalmente, los \u00e9steres de forbol u otros activadores de la pkc deben inducir la separaci\u00f3n del complejo rick\/pkc.  racks \testas prote\u00ednas est\u00e1n presentes en la fracci\u00f3n celular particulada y unen la quinasa c activa de forma selectiva y saturable. En estos casos, un puente de ps parece no ser suficiente para establecer la uni\u00f3n, sino que se requieren interacciones prote\u00edna-prote\u00edna directas. Otra propiedad de esta interacci\u00f3n es que la uni\u00f3n de la pkc al rack no est\u00e1 inhibida por p\u00e9ptidos sustrato, indicando que el anclaje no se produce en el lugar catal\u00edtico o lugares de fosforilaci\u00f3n de la pkc.   sustratos de pkc  \tsustratos de pkc \u00abin vitro\u00bb \tdurante cierto tiempo se observ\u00f3 que, al menos, \u00abin vitro\u00bb las cpkcs eran serina \/ treonina quinasas no espec\u00edficas. Por tanto, cualquier prote\u00edna b\u00e1sica, como histona hi, hiiis, prote\u00edna b\u00e1sica de mielina (mbp), protamina u otros p\u00e9ptidos podr\u00edan utilizarse como sustratos, siempre y cuando tuvieran la secuencia xrxxs\/txrx; siendo este rasgo muy distinto de la especificad de sustrato que presentaban muchas de las quinasas estudiadas hasta entonces. Sin embargo, una comparaci\u00f3n de las isoenzimas de pkc y sus actividades hacia distintos sustratos, \u00abin vitro\u00bb, ha mostrado diferencias que pueden indicar una cierta especificad hacia los sustratos naturales bajo condiciones fisiol\u00f3gicas.  sustratos de pkc \u00abin vivo\u00bb \ten cuanto a los sustratos de pkc in vivo resaltar que: mediante el marcaje de c\u00e9lulas con 32p y estimulaci\u00f3n de las mismas con \u00e9steres de forbol u otros agonistas que estimulan la pkc, se han descubierto muchos posibles sustratos fisiol\u00f3gicos. hay tres sustratos importantes en el control de la proliferaci\u00f3n celular: a) marks su fosforilaci\u00f3n lleva a una redistribuci\u00f3n de los filamentos de actina desde la membrana al citoplasma; b) y c) dna topoisomerasa  y lamina b, que son prote\u00ednas nucleares implicadas en el control de la s\u00edntesis de dna, y que dar\u00edan relevancia a la translocaci\u00f3n de la pkc al n\u00facleo. \tlas prote\u00ednas marcks (sustratos de la quinasa c ricos en alanina miristoilada) y prote\u00ednas relacionadas con marcks (mrp) est\u00e1n distribuidas extensamente como prote\u00ednas unidas a las membranas, son los principales sustratos de las pkcs y est\u00e1n implicadas en la propagaci\u00f3n de las c\u00e9lulas, la activaci\u00f3n de la integrina y la exocitosis. Marcks, se une a la f-actina y puede funcionar como un puente cruzado entre la actina del citoesqueleto y la membrana plasm\u00e1tica.  su importancia es debida al hallazgo de que marcks est\u00e1n implicadas directamente en la hipersecreci\u00f3n de mucus que ocurre durante enfermedades tales como el asma, y la bronquitis o fibrosis c\u00edstica cr\u00f3nicas.   \tinhibidores de pkc \tse denomina inhibidor  a toda sustancia que se une a una enzima y reduce la velocidad de la reacci\u00f3n que cataliza. La inhibici\u00f3n de algunas enzimas por inhibidores espec\u00edficos constituye un importante sistema de regulaci\u00f3n de las reacciones que ocurren en las c\u00e9lulas y en ciertos casos tiene aplicaciones cl\u00ednicas.  \tpodemos clasificar los inhibidores en dos tipos:  inhibidores irreversibles inhibidores irreversibles (inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos).  seg\u00fan el mecanismo de acci\u00f3n de los inhibidores tambi\u00e9n podemos clasificarlos en:  a) inhibidores de la uni\u00f3n de atp (ej: bisindolilmaleimidas e indolcarbazoles, son derivados de la estaurosporina). b) inhibidores que act\u00faan en la regi\u00f3n c1 afectando a la uni\u00f3n de \u00e9steres de forbol \/ dag (ej: calfostina c, gossipol, etc). c) inhibidores de la interacci\u00f3n pkc-fosfol\u00edpido (ej: curcumina, propanolol, dibucaina, etc). d) prote\u00ednas que inhiben la pkc (ej: kcip, calciprote\u00ednas, etc). e) agentes disruptivos de membrana (ej: etanol, tocoferoles, etc).  f) inhibidores qu\u00edmicos y otras drogas [ej: antralina, pb2+, complejos de pt (ii), etc].   pkc en eucariotas inferiores \tadem\u00e1s de en mam\u00edferos, pkc o prote\u00ednas relacionadas con la pkc se han encontrado en eucariotas inferiores tales como levaduras en otros organismos como drosophila, caenorhabditis elegans; dictyostelium y oocitos de xenopus laevis.  \ten saccharomyces cerevisiae se han encontrado tres isoformas similares a las pkcs del grupo de las cl\u00e1sicas; estas isoformas fueron activadas por ca2+, ps y dag o pma, utilizando la histona iii-s como sustrato. Por el contrario, ogita y sus colaboradores (1990) aislaron una pkc a partir de s. Cerevisiae, que fue activada por ca2+, ps y dag, pero no por pma. En drosophila se han encontrado tres isoformas de la pkc, dos son similares a las pkcs cl\u00e1sicas de mam\u00edferos y la tercera es hom\u00f3loga a la pkc \u00c2\u00bf.  1.8.1. Pkc en moluscos \ten moluscos, por clonaje molecular kruger y sus colaboradores (1991) obtuvieron evidencias acerca de la existencia de dos isoformas de pkc en el molusco marino aplysia californica, apl i y apl ii, las cuales se expresan abundantemente en el sistema nervioso.  \ten las neuronas de aplysia, la activaci\u00f3n de la pkc est\u00e1 implicada en la modulaci\u00f3n neuronal, que incluye la facilitaci\u00f3n presin\u00e1ptica entre las neuronas sensoriales y las motoras; un proceso celular que est\u00e1 implicado en la sensibilizaci\u00f3n o deshabituaci\u00f3n. \tla quinasa apl i es fuertemente activada por los \u00e1cidos grasos de configuraci\u00f3n cis, pero s\u00f3lo en presencia de ca2+. Adem\u00e1s, funcionalmente apl i es m\u00e1s parecida a las isoformas \u00c2\u00bf y \u00edY de vertebrados que a la isoforma \u00c2\u00bf neural de vertebrados. La quinasa apl ii es ca2+ independiente y se parece a la pkc \u00c2\u00bf de vertebrados.   pkc y pka en m. Galloprovincialis  en cuanto al mejill\u00f3n, nuestro grupo de trabajo ha abordado como objetivo durante los ultimos a\u00f1os el estudio de las prote\u00ednas quinasas en este molusco. As\u00ed se ha purificado una prote\u00edna quinasa dependiente de ampc (pka) de manto de m. Galloprovincialis que se ha visto involucrada en la fosforilaci\u00f3n de la fosfofructoquinasa-1 (pfk-1) de manto de la misma especie. Adem\u00e1s se ha podido correlacionar los \u00edndices de actividad quinasa con los niveles de ampc, en el mismo tejido. \tpor otra parte en m. Galloprovincialis (lmk) han sido identificadas en  manto, branquias y pie, 3 isoformas de pkc, que fueron reconocidas como pkc \u00c2\u00bf, pkc \u00edY y pkc \u00c2\u00bf, mediante la utilizaci\u00f3n de anticuerpos contra las respectivas isoenzimas de mam\u00edfero. \tm\u00e1s recientemente nuestro grupo de trabajo ha purificado y caracterizado bioqu\u00edmicamente una npkc en el manto de mejill\u00f3n con un peso molecular de 105 kda, la cual se  ha denominado como p105, presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil l-serina y pma e independiente de ca2+. Se comprob\u00f3 que la p105, estaba presente en manto, branquias, pie, m\u00fasculo aductor posterior, hepatopr\u00e1ncreas y hemocitos de m. Galloprovincialis. \u00abIn vitro\u00bb, la prote\u00edna p105 es capaz de autofosforilarse sin la presencia de cofactores lip\u00eddicos, los par\u00e1metros cin\u00e9ticos de esta prote\u00edna, la asemejan a una isoforma npkc de mam\u00edferos.   el modelo experimental: mytilus galloprovincialis lmk \tlos mejillones del g\u00e9nero mytilus se localizan en aguas litorales y sublitorales poco profundas, tanto en litoral abierto como en estuarios de aguas salobres. Preferentemente se asientan en lugares de aguas movidas y viven de forma s\u00e9sil adheridos por medio del biso a sustratos resistentes, como rocas, guijarros y arenas de mar compactas. El tipo de vida, as\u00ed como su localizaci\u00f3n litoral lo exponen a las condiciones t\u00edpicas de la vida intermareal, en la cual uno de los principales condicionantes es la exposici\u00f3n peri\u00f3dica al aire durante la marea baja. El l\u00edmite superior de supervivencia de esta zona viene impuesto por la duraci\u00f3n del per\u00edodo de exposici\u00f3n al aire y por el grado de humedad disponible durante ese tiempo. \tlos moluscos bivalvos son animales prot\u00f3stomos celomados, con simetr\u00eda bilateral y no segmentados. Presentan una concha que se encuentra formada por dos valvas iguales, unidas dorsalmente y entre las cuales se dispone el cuerpo y la cavidad paleal. La musculatura se encuentra adherida a la concha y son los m\u00fasculos aductores, anterior (maa) y posterior (map), los m\u00e1s destacados. En la cavidad paleal sobresalen las branquias, que adem\u00e1s de actuar como \u00f3rgano respiratorio, colaboran en la alimentaci\u00f3n. El aparato digestivo de mytilus consta de boca (rodeada de palpos labiales), es\u00f3fago estomago e intestino. Rodeando al est\u00f3mago y parte del intestino se localiza la gl\u00e1ndula digestiva o hepatop\u00e1ncreas. El manto es el principal tejido de reserva del molusco y permanece adherido a la concha por unas fibras musculares que constituyen la l\u00ednea o seno paleal. El pie es un \u00f3rgano musculoso, con forma de hoja y comprimido lateralmente, cuyos movimientos se consiguen por una combinaci\u00f3n de acciones musculares y de presi\u00f3n hidr\u00e1ulica.   inmunidad: sistemas y respuestas inmunitarias \tel sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y humorales que interaccionan para proteger al organismo de pat\u00f3genos, par\u00e1sitos y c\u00e9lulas neopl\u00e1sicas, de forma que todos los organismos manifiestan una capacidad determinada gen\u00e9ticamente para distinguir entre lo propio y lo extra\u00f1o. Los organismos multicelulares poco evolucionados s\u00f3lo presentan un tipo de inmunidad, denominada innata que es exclusivamente celular y filogen\u00e9ticamente m\u00e1s antigua que la inmunidad adquirida, que est\u00e1 presente en organismos como peces (cartilaginosos y \u00f3seos), anfibios, reptiles, aves y mam\u00edferos.  c\u00e9lulas y tejidos del sistema inmune en invertebrados \ten el sistema circulatorio de invertebrados, se detecta una gran variedad de tipos de c\u00e9lulas sangu\u00edneas, las cuales, aparentemente, desempe\u00f1an funciones variadas como son transporte, almacenamiento, reparaci\u00f3n de heridas y pigmentaci\u00f3n, as\u00ed como defensa del organismo. Las respuestas celulares son realizadas por hemocitos, los cuales poseen la capacidad de fagocitar pat\u00f3genos y desarrollar el proceso de encapsulaci\u00f3n de metazoos.   poblaciones celulares en hemolinfa de moluscos bivalvos \texisten diferentes opiniones en relaci\u00f3n al n\u00famero y tipo de hemocitos en moluscos bivalvos, as\u00ed como en su clasificaci\u00f3n celular. La existencia de diversos tipos de clasificaci\u00f3n se debe a la variabilidad de t\u00e9cnicas empleadas, que abarcan desde las morfol\u00f3gicas hasta la citrometr\u00eda de flujo. \ten la hemolinfa de m. Galloprovincialis han sido detectados dos tipos diferentes de c\u00e9lulas. En primer lugar, un grupo de c\u00e9lulas peque\u00f1as redondeadas, denominadas c\u00e9lulas rh, con un n\u00facleo que ocupa casi la totalidad de la c\u00e9lula y un peque\u00f1o volumen de citoplasma, que a veces es tan s\u00f3lo un halo alrededor del n\u00facleo. \tel segundo tipo celular encontrado en hemolinfa de m. Galloprovincialis, presenta un mayor tama\u00f1o y un citoplasma expandido, son las c\u00e9lulas sh.   el lipopolisac\u00e1rido bacteriano (lps) y las citoquinas en la respuesta inmune \tla respuesta inmune est\u00e1 regulada por m\u00faltiples y complejas interacciones entre mol\u00e9culas, las cuales desencadenan se\u00f1ales de transducci\u00f3n intercelulares. Algunas de estas mol\u00e9culas importantes en la respuesta inmunitaria son el lipopolisac\u00e1rido bacteriano y las citoquinas.El lipopolisac\u00e1rido o lps es el principal componente de la membrana externa de bacterias gram-negativas y posee la capacidad para activar macr\u00f3fagos de vertebrados y hemocitos de invertebrados.     objetivos en el presente trabajo se propone como objetivo global, el estudio en manto de mejill\u00f3n m. Galloprovincialis de alguna isoforma de las cpkcs descritas en otros organismos. \teste objetivo general puede dividirse en varios subobjetivos: 1)\tdeterminar la presencia de actividad cpkc en el manto del mejill\u00f3n mytilus galloprovincialis lmk.  2)\tpurificar y caracterizar bioqu\u00edmicamente dicha isoforma de cpkc. 3)\testudiar la distribuci\u00f3n tisular de la isoforma cpkc purificada del mejill\u00f3n m. Galloprovincialis lmk. Y determinar su ubicaci\u00f3n predominante en las fracciones citos\u00f3lica y de membrana. 4)\tobtener anticuerpos policlonales espec\u00edficos contra la isoforma cpkc purificada, como herramienta para el estudio de la enzima. 5)\tdeterminar la presencia de la isoforma cpkc purificada en los hemocitos del mejill\u00f3n y estudiar el efecto de diferentes inductores (il-2, pdgf y lps) sobre la expresi\u00f3n de esta cpkc en los hemocitos de m. Galloprovincialis lmk.  6)\trealizar un estudio comparativo de los resultados obtenidos para la forma dependiente de calcio (cpkc) y los obtenidos para la forma independiente de calcio (p105). Para alcanzar este objetivo previamente es necesario completar los siguientes pasos. \t6.1. Purificar la isoforma npkc (p105).   \t6.2. Completar el estudio cin\u00e9tico realizado por mercado, (2001), para la enzima p105 utilizando otros p\u00e9ptidos sustratos.    \t6.3. Estudiar el efecto producido por diferentes inductores (il-2, pdgf y lps) sobre la expresi\u00f3n de p105 en hemocitos de m. Galloprovincialis lmk.           resultados y discusi\u00f3n \tnuestra investigaci\u00f3n se centr\u00f3 en el dise\u00f1o de un m\u00e9todo eficaz para la purificaci\u00f3n de una prote\u00edna tipo cpkc de manto de mejill\u00f3n y comparar los resultados obtenidos para esta con los resultados previos obtenidos por mercado y colaboradores. \tal ser las pkcs enzimas translocables se pueden encontrar tanto asociadas a la fracci\u00f3n citosolica como a la membrana plasm\u00e1tica. Aunque algunos autores han utilizado, preferentemente la fracci\u00f3n de membrana para la purificaci\u00f3n de npkcs tanto en vertebrados  como en invertebrados, su purificaci\u00f3n puede ser m\u00e1s eficiente a partir de la fracci\u00f3n citosolica, tal como han demostrado en este laboratorio mercado y colaboradores.  \tla purificaci\u00f3n de la enzima p60 se hizo a partir del manto de m. Galloprovincialis, que hab\u00eda mostrado una elevada actividad cpkc en el estudio preliminar.  \tel primer paso cromatogr\u00e1fico es com\u00fan a otras purificaciones de cpkcs y npkcs. Las isoformas de cpkcs de vertebrados se eluyen de deae sepharose con una baja fuerza i\u00f3nica. En higado de rata se obtiene un pico de actividad pkc cuando la concentraci\u00f3n de nacl es aproximadamente 100 mm. Las prote\u00ednas con actividad cpkc y npkc que hemos purificado a partir de manto de m. Galloprovincialis, requieren en ambos casos de una fuerza i\u00f3nica menor para su eluci\u00f3n, nacl 25 mm. \tla cromatograf\u00eda de gel filtraci\u00f3n en la columna superdex 200 hr 10\/30 permiti\u00f3 purificar a homogeneidad la cpkc de 60 kda que denominamos como p60 y tambi\u00e9n se puede observar como la otra prote\u00edna de 105 kda que denominamos como p105 se va separando de p60 a medida que progresa la cromatograf\u00eda pasando a tener la p60 totalmente pura en el 2\u00c2\u00ba pico del cromatograma.  \tla cromatograf\u00eda de adsorci\u00f3n sobre htp, suele ser la que mejor determina la eliminaci\u00f3n de contaminantes. En nuestro caso ha permitido obtener la enzima p105 pura, cuando se eluye con fosfato de potasio 300 mm. En la purificaci\u00f3n de isoformas de pkc en el molusco aplysia, tambi\u00e9n se utiliza la cromatograf\u00eda sobre htp como \u00faltimo paso de purificaci\u00f3n, obteni\u00e9ndose dos picos de actividad pkc, uno cuando el fosfato de potasio alcanza una concentraci\u00f3n de 180 mm, y otro se recoge con una concentraci\u00f3n de 400 mm. Este segundo pico es coincidente con el que se obtiene con la enzima p105 de mejill\u00f3n.  \tla purificaci\u00f3n por m\u00e9todos convencionales de isoformas de pkc de invertebrados no es un tema profundamente estudiado. Es el caso del camar\u00f3n penaeus monodon, de cuyo hepatop\u00e1ncreas se purificaron tres isoformas similares a pkc \u00c2\u00bf, con un peso molecular de 62, 60 y 58 kda. (Es posible que la prote\u00edna p60 purificada en el presente trabajo sea similar a alguna de estas pkc delta purificadas por nishizuka). Debido a la utilizaci\u00f3n del molusco aplysia como modelo para el estudio de las bases neurol\u00f3gicas del aprendizaje, es en esta especie donde se han caracterizado con mayor detalle las isoformas existentes de pkc. De ganglios neuronales de este molusco se han purificado dos pkcs de las cuales la llamada apl-ii posee una masa molecular de 87 kda, mientras que la forma dependiente de calcio o apl-i, posee una masa molecular de 74 kda. En ambos casos menor que la de p105 y mayor que la de p60.\tPor la cercan\u00eda filogen\u00e9tica entre aplysia y el mejill\u00f3n m. Galloprovincialis es probable que apl-li y p105 sean isoformas similares, a\u00fan a pesar de la diferencia de peso molecular. En cuanto a la relaci\u00f3n que existe entre estas prote\u00ednas y las isoformas de mam\u00edferos solo se puede se\u00f1alar que los estudios m\u00e1s avanzados en aplysia, han permitido su clonaci\u00f3n y se ha constatado una analog\u00eda en su secuencia con pkc \u00c2\u00bf de mam\u00edferos.  \ten el presente trabajo se estudi\u00f3 la cin\u00e9tica de la prote\u00edna quinasa p60 frente a los sustratos m\u00e1s caracter\u00edsticos, obteni\u00e9ndose para el p\u00e9ptido t5 una km de 68,12 \u00c2\u00b5m, para el p\u00e9ptido t3 se obtiene una km de 841,9  \u00c2\u00b5m, por otro lado para la mbp se obtuvo una km de 69,41 \u00c2\u00b5m, para la histona iii-s obtuvimos una km = 237,98 \u00c2\u00b5m y por ultimo para la protamina sulfato el valor de km fue de 13,46 \u00c2\u00b5m.  \tcon respecto a la actividad quinasa de las prote\u00ednas p60 y p105, los par\u00e1metros cin\u00e9ticos que hemos obtenido coinciden con los antecedentes descritos para npkcs de mam\u00edferos, las cuales fosforilan d\u00e9bilmente la histona iii-s y la mbp, mientras que tienen una alta afinidad por la protamina sulfato. Por tanto ha sido necesaria la utilizaci\u00f3n de p\u00e9ptidos sint\u00e9ticos derivados de la secuencia del pseudosustrato o de mbp, o del receptor de crecimiento epid\u00e9rmico (egf), para ensayar la actividad quinasa de las npkcs. \tlos resultados obtenidos en nuestro laboratorio para la prote\u00edna p105 por mercado y colaboradores, as\u00ed como los obtenidos para la enzima p60 en el presente trabajo muestran que la p60 muestra una actividad hacia los diferentes p\u00e9ptidos sustratos ensayados del orden de 20 veces m\u00e1s altos que para la p105. La alta actividad fosforilante que p60 y p105 desarrollan con la protamina sulfato, podr\u00eda deberse a que presenta dos sitios de fosforilaci\u00f3n en su secuencia, prrrrsssrpvrrrrrprvsrrrrrrggrrr, en s6 y s20, en comparaci\u00f3n con los otros sustratos probados que solo presentan un sitio de fosforilaci\u00f3n. Las actividades enzim\u00e1ticas sugieren que p105 podr\u00eda catalizar las reacciones de fosforilaci\u00f3n de una manera similar a pkc \u00c2\u00bf. Los valores de vm\u00e1x obtenidos para el p\u00e9ptido sustrato comercial  de 9 residuos (vrkrtlrrl) o (t-5) y el p\u00e9ptido sustrato para pkc \u00c2\u00bf, ermrprkrqgsvrrrv (s-11), son similares a las que se obtienen con la pkc \u00c2\u00bf de mam\u00edferos. La prote\u00edna p105 no solo es independiente de ca2+, sino que adem\u00e1s es inhibida por \u00e9l. Esta caracter\u00edstica ya ha sido descrita en isoformas de npkc de mam\u00edferos, en un tipo descrito simplemente como npkc y en el otro que comprende a pkc \u00c2\u00bf. Para la enzima p105 de manto de mejill\u00f3n, la inhibici\u00f3n es de tipo mixta. Siendo preferentemente m\u00e1s af\u00edn por la enzima libre, ki 0,6 mm que por el complejo enzima-sustrato, ki\u00c2\u00bf 2 mm. \ten la mayor\u00eda de c\u00e9lulas estimuladas, la concentraci\u00f3n de ca2+ se incrementa solo transitoriamente, mientras que  las respuestas fisiol\u00f3gicas persisten durante un largo periodo de tiempo una vez que la concentraci\u00f3n de ca2+ ya retorn\u00f3 a concentraciones basales. La prolongada activaci\u00f3n de pkc parece ser responsable del mantenimiento en la respuesta celular. La movilizaci\u00f3n del ca2+ y la activaci\u00f3n de pkc act\u00faan sinergicamente causando una variedad de repuestas celulares, pero el mecanismo bioqu\u00edmico de este sinergismo no est\u00e1 completamente estudiado. La movilizaci\u00f3n del ca2+ y la degradaci\u00f3n del fosfol\u00edpido est\u00e1n  \u00edntimamente relacionadas, y en ocasiones son complementarias entre si. En presencia de altas concentraciones de ca2+, la activaci\u00f3n de pkc requiere de una peque\u00f1a degradaci\u00f3n fosfolip\u00eddica, as\u00ed como en presencia de una intensa degradaci\u00f3n fosfolip\u00eddica se requiere de una peque\u00f1a cantidad de ca2+ para activar la enzima.     \tpor otra parte en este estudio, hemos determinado que p60 no solo es dependiente de ca2+, sino que se ha comprobado que la concentraci\u00f3n \u00f3ptima de ca2+ para esta enzima es de 0,65 mm. \ten este trabajo, tambi\u00e9n hemos estudiado los efectos de inhibici\u00f3n provocados sobre p60 por inhibidores que compiten por la uni\u00f3n del atp (como la estaurosoporina, para la cual se obtuvo una ki = 20,3 \u00c2\u00b5m  o la bisindolilmaleimida, para esta el valor de la cte de inhibici\u00f3n fue de ki = 1,765 \u00c2\u00b5m), tambi\u00e9n se ensay\u00f3 el efecto producido por inhibidores de la interacci\u00f3n pkc\/fosfol\u00edpido  (en nuestro caso se utiliz\u00f3 la curcumina como agente representativo de este grupo de inhibidores y se obtuvo una ki = 13,16 \u00c2\u00b5m). Se observa que para los tres casos se obtiene una inhibici\u00f3n de tipo competitiva.  \ten el nematodo caenorhabditis elegans, la actividad de pkc fue inhibida por los inhibidores de prote\u00edna quinasa h7 y estaurosporina. Se obtuvo una inhibici\u00f3n m\u00e1xima para concentraciones que oscilaban entre 9 \u00c2\u00b5m y 8 nm respectivamente. Se ha confirmado que los inhibidores h7 y un inhibidor espec\u00edfico del p\u00e9ptido de pkc rfarkgalrqknvhevkn inhiben la fosforilaci\u00f3n del p\u00e9ptido estimulada por el ca2+ \/ fosfol\u00edpido en m\u00e1s de un  98%. para profundizar en la caracterizaci\u00f3n de las enzimas se obtuvieron anticuerpos policlonales contra p60 y p105. Los anticuerpos obtenidos son espec\u00edficos para las prote\u00ednas puras, y no se observ\u00f3 reacci\u00f3n cruzada en las inmunodetecciones realizadas para las dos isoformas purificadas frente a los respectivos anticuerpos. \tel an\u00e1lisis de p105, evidenci\u00f3 una caracter\u00edstica que la prote\u00edna comparte con otras npkcs descritas en mam\u00edferos, pkc \u00c2\u00bf, pkc \u00c2\u00bf y pkc \u00c2\u00bf. Todas estas isoformas presentan un<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Purificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de una isoforma calcio dependiente de prote\u00edna quinasa c en mytilus galloprovincialis lmk.<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Purificaci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n de una isoforma calcio dependiente de prote\u00edna quinasa c en mytilus galloprovincialis lmk. <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Mart\u00edn Gonz\u00e1lez Riopedre <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 27\/02\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Juan  Ignacio Ramos Martinez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Santiago Rodr\u00edguez-segade villamar\u00edn <\/li>\n<li>M\u00aa asunci\u00f3n Cao hermida (vocal)<\/li>\n<li>pedro alfonso Lazo-zbikowski taracena (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Mart\u00edn Gonz\u00e1lez Riopedre Introducci\u00f3n las quinasas las quinasas son enzimas fosforilantes que catalizan la adici\u00f3n de un 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