{"id":92058,"date":"2009-05-03T00:00:00","date_gmt":"2009-05-03T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/regulacion-de-las-e3-ubiquitina-ligasas-itch-aip4-y-wwp1-aip5-mediante-sus-dominios-ww\/"},"modified":"2009-05-03T00:00:00","modified_gmt":"2009-05-03T00:00:00","slug":"regulacion-de-las-e3-ubiquitina-ligasas-itch-aip4-y-wwp1-aip5-mediante-sus-dominios-ww","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/bioquimica-molecular\/regulacion-de-las-e3-ubiquitina-ligasas-itch-aip4-y-wwp1-aip5-mediante-sus-dominios-ww\/","title":{"rendered":"Regulaci\u00f3n de las e3 ubiquitina ligasas itch (aip4) y wwp1 (aip5) mediante sus dominios ww"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Begonya Morales Juan \u00f3s <\/strong><\/h2>\n<p>Las enzimas e3 o ligasas de ubiquitina son las encargadas de seleccionar y marcar con ubiquitinas numerosas prote\u00ednas para alterar su localizaci\u00f3n celular o para enviarlas al proteosoma para su degradaci\u00f3n. Estas enzimas reconocen el sustrato y catalizan la uni\u00f3n covalente de varias unidades de ubiquitina a la prote\u00edna diana. De esta manera el sustrato unido a la cadena de poliubiquitinas queda marcado para su posterior degradaci\u00f3n en el proteosoma. Fallos en alguno o varios pasos de este proceso conducen a la acumulaci\u00f3n o d\u00e9ficit de las prote\u00ednas diana. Esta falta de regulaci\u00f3n puede dar lugar a cascadas de reacciones descontroladas que terminan originando graves enfermedades. Por ejemplo, se han detectado defectos en el funcionamiento de smurf2 en c\u00e1ncer de es\u00f3fago, de wwp1 en c\u00e1nceres de pr\u00f3stata y de mama y de nedd4 en c\u00e1ncer de ves\u00edcula. En el caso de itch, errores en su funcionamiento contribuyen al desarrollo de enfermedades autoinmunes ya que juega un papel cr\u00edtico en la diferenciaci\u00f3n de c\u00e9lulas del tipo t. este trabajo se centra en el estudio de las e3 de la familia nedd4. Estas e3 son prote\u00ednas modulares cuya composici\u00f3n en dominios se ha mantenido conservada durante la evoluci\u00f3n de metazoos, por lo que tambi\u00e9n se las conoce como ligasas del tipo c2-wws-hectt. Las ligasas tipo nedd4 reconocen sus sustratos mediante interacciones entre sus dominios ww y secuencias con el motivo l\/ppxy presentes en los distintos sustratos. Su dominio catal\u00edtico c-terminal hect es el que transfiere la ubiquitina a la prote\u00edna diana. en esta tesis se ha descrito c\u00f3mo itch, una e3 tipo nedd4, reconoce 2 sustratos: la prote\u00edna de membrana lmp2a del virus epstein-barr y el factor de transcripci\u00f3n junb. Para ello se han utilizado la espectroscopia de rmn y fluorescencia. Se ha resuelto la estructura del tercer dominio ww de itch en complejo con un p\u00e9ptido de la prote\u00edna lmp2a y se ha analizado mediante mutaciones puntuales el papel de determinadas interacciones en la formaci\u00f3n del complejo. Adem\u00e1s se ha estudiado c\u00f3mo 2 fosforilaciones influyen en el reconocimiento intermolecular. Anteriormente se hab\u00eda demostrado en el mismo laboratorio que la fosforilaci\u00f3n de la tirosina del ligando (l\/ppxy) disminuye la afinidad del complejo, en este trabajo se estudi\u00f3 como puede ser compensado el impedimento esf\u00e9rico que supone el grupo fosfato en la uni\u00f3n entre las dos prote\u00ednas. Estudios recientes demuestran que en la c\u00e9lula esta disminuci\u00f3n de la afinidad podr\u00eda ser suficiente para que las dos prote\u00ednas no se unan. hasta la fecha la mayor\u00eda de estudios se han centrado en la fosforilaci\u00f3n del sustrato como mecanismo de regulaci\u00f3n del reconocimiento de la e3 por la prote\u00edna diana. En este trabajo se investig\u00f3 el efecto de la fosforilaci\u00f3n del dominio ww de la e3 en una treonina (t30). Este amino\u00e1cido est\u00e1 ubicado dos residuos antes del segundo tript\u00f3fano de los dominios ww y est\u00e1 conservado en la mayor\u00eda de los dominios ww como un residuo fosforilable (s\/t). Utilizando rmn se demostr\u00f3 que la fosforilaci\u00f3n de este residuo inhibe completamente la uni\u00f3n del dominio ww3 de itch al p\u00e9ptido de lmp2a. Mediante experimentos de fosforilaci\u00f3n in vitro se comprob\u00f3 adem\u00e1s que existen quinasas capaces de realizar esta fosforilaci\u00f3n en diversos dominios ww. La conservaci\u00f3n de este residuo como s\/t en todos los dominios ww hace pensar que este podr\u00eda ser un mecanismo de regulaci\u00f3n de la interacci\u00f3n de estos dominios con sus sustratos. por otro lado, estudios recientes demostraron la existencia de contactos intramoleculares en itch que fueron interpretados como que el enzima adopta una conformaci\u00f3n cerrada inactiva que se abre al sufrir una fosforilaci\u00f3n en la secuencia conectora entre el dominio c2 y la zona central que contiene los dominios ww. Las e3 con dominios hect son capaces de actuar sobre s\u00ed mismas y parece ser que esta conformaci\u00f3n cerrada impide la auto-degradaci\u00f3n de estas enzimas. un an\u00e1lisis de secuencias de e3 tipo nedd4 mostr\u00f3 una zona pr\u00f3xima al extremo c-terminal del dominio hect muy conservada que contiene un motivo semejante a los reconocidos normalmente por dominios ww, lppy. Para comprobar si esta regi\u00f3n interacciona con un dominio ww de la misma enzima se sintetiz\u00f3 un p\u00e9ptido de 15 residuos con el motivo lppy y se realizaron valoraciones del tercer dominio ww de las e3 itch y de wwp1 en presencia de este p\u00e9ptido. Wwp1 es otra e3 tipo nedd4 cuya estructura del dominio hect ha sido resuelta mediante cristalograf\u00eda y que presenta una identidad de secuencia del 83 % con itch. Las valoraciones fueron monitorizadas mediante rmn y se observaron cambios de desplazamientos qu\u00edmicos en algunos residuos que indicaron que existe interacci\u00f3n entre los dos dominios ww y el p\u00e9ptido conservado en las e3. posteriormente realiz\u00f3 el clonaje, la expresi\u00f3n y purificaci\u00f3n del subdominio de c-terminal del dominio catal\u00edtico hect de la prote\u00edna wwp1 (130 residuos) y se le a\u00f1adi\u00f3 el dominio ww3 de wwp1. Los cambios en algunos desplazamientos qu\u00edmicos demostraron que los dos dominios interaccionan. Por \u00faltimo se adquirieron experimentos de triple resonancia del subdominio c-terminal para asignar su esqueleto. De esta manera se identificaron por primera vez los residuos del dominio hect implicados en esta interacci\u00f3n intramolecular que induce una conformaci\u00f3n cerrada inactiva de la e3.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Regulaci\u00f3n de las e3 ubiquitina ligasas itch (aip4) y wwp1 (aip5) mediante sus dominios ww<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Regulaci\u00f3n de las e3 ubiquitina ligasas itch (aip4) y wwp1 (aip5) mediante sus dominios ww <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Begonya Morales Juan \u00f3s <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 05\/03\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Mar\u00eda Jes\u00fas Mac\u00edas Hern\u00e1ndez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: miquel Pons valles <\/li>\n<li>Mar\u00eda  concepci\u00f3n Civera tejuca (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Begonya Morales Juan \u00f3s Las enzimas e3 o ligasas de ubiquitina son las encargadas de seleccionar y 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