{"id":92061,"date":"2009-05-03T00:00:00","date_gmt":"2009-05-03T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/inestabilidad-genetica-asociada-a-transcripcion\/"},"modified":"2009-05-03T00:00:00","modified_gmt":"2009-05-03T00:00:00","slug":"inestabilidad-genetica-asociada-a-transcripcion","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/levaduras\/inestabilidad-genetica-asociada-a-transcripcion\/","title":{"rendered":"Inestabilidad gen\u00e9tica asociada a transcripci\u00f3n"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Bel\u00e9n G\u00f3mez Gonz\u00e1lez <\/strong><\/h2>\n<p>Durante el metabolismo del adn tienen lugar diversos procesos, como son la replicaci\u00f3n, transcripci\u00f3n o la reparaci\u00f3n. Dada la simultaneidad de los mismos, se requiere una alta coordinaci\u00f3n para preservar la integridad de la informaci\u00f3n gen\u00e9tica y evitar la inestabilidad de los genomas. La inestabilidad gen\u00e9tica se asocia frecuentemente a determinados tipos de enfermedades gen\u00e9ticas y muchos de los genes involucrados en el mantenimiento de la estabilidad gen\u00e9tica act\u00faan como supresores de la formaci\u00f3n de tumores. No obstante, la inestabilidad gen\u00e9tica tambi\u00e9n es crucial en la evoluci\u00f3n de los organismos ya que constituye una fuente de variabilidad gen\u00e9tica. Adem\u00e1s, juega un papel muy importante en procesos esenciales  en el desarrollo como son las reordenaciones de los genes de las inmunoglobulinas (maizels, 2005). dentro del t\u00e9rmino inestabilidad gen\u00e9tica se incluyen todas las alteraciones gen\u00e9ticas, desde mutaciones puntuales a reorganizaciones cromos\u00f3micas. Entre los factores que influyen en el mantenimiento de la estabilidad gen\u00e9tica podemos distinguir aquellos que act\u00faan en trans o en cis. Es decir, existen procesos como la replicaci\u00f3n o la reparaci\u00f3n cuyos errores pueden generar inestabilidad gen\u00e9tica, o los mecanismos de control (checkpoints) que previenen la acumulaci\u00f3n de dichos fallos durante todo el ciclo celular. Por otra parte, existen lugares en el genoma que poseen una especial propensi\u00f3n a la inestabilidad, como son los llamados sitios fr\u00e1giles o las secuencias que se transcriben mucho.  as\u00ed, la transcripci\u00f3n del adn est\u00e1 entre los factores que pueden originar la inestabilidad gen\u00e9tica. Podemos encontrar un ejemplo de inestabilidad gen\u00e9tica asociada a transcripci\u00f3n en procesos naturales como la diversificaci\u00f3n de los genes que codifican para los anticuerpos en eucariotas superiores. La transcripci\u00f3n de secuencias espec\u00edficas es esencial para que tengan lugar la recombinaci\u00f3n espec\u00edfica de sitio v(d)j, y posteriormente, la recombinaci\u00f3n de cambio de clase (csr) y la hipermutaci\u00f3n som\u00e1tica (shm) . En estos dos \u00faltimos procesos interviene la prote\u00edna aid (activation-induced cytidine deaminase) (muramatsu et al., 2000; okazaki et al., 2002; revy et al., 2000) (revisado en  (di noia and neuberger, 2007)). Aunque esta enzima fue inicialmente identificada por su similitud con apobec-1, que act\u00faa sobre el arn, existen bastantes evidencias a favor de que aid act\u00faa directamente sobre el adn de las regiones s y v para iniciar los procesos de csr y shm, respectivamente (petersen-mahrt et al., 2002). La especificidad de acci\u00f3n de aid parece depender de que el adn se encuentre en forma de cadena sencilla, como ocurre cuando se transcribe (bransteitter et al., 2003; chaudhuri et al., 2003; sohail et al., 2003). En este sentido se ha descrito la formaci\u00f3n de un h\u00edbrido adn-arn en dichas regiones s, lo que genera la formaci\u00f3n de cadena sencilla en la cadena no transcrita del adn (daniels and lieber, 1995; reaban et al., 1994; yu et al., 2003). Dicha cadena sencilla puede adem\u00e1s estabilizarse  por la formaci\u00f3n de estructuras llamadas g-quartets debido al alto contenido en gc de las regiones s (dempsey et al., 1999; duquette et al., 2004). As\u00ed, parece que la transcripci\u00f3n puede intervenir en la especificidad de acci\u00f3n de aid mediante la formaci\u00f3n de adn de cadena sencilla. No obstante, la acci\u00f3n de aid ha de requerir factores adicionales, pues no todos los genes que se transcriben son diana de esta enzima potencialmente mutadora, sino que su acci\u00f3n se restringe a los genes de las inmunoglobulinas. de manera m\u00e1s general, tanto la mutaci\u00f3n espont\u00e1nea como la recombinaci\u00f3n de una secuencia particular de adn son significativamente m\u00e1s altas cuando \u00e9sta se transcribe. Esto se ha descrito tanto en procariotas como en eucariotas y se conoce como tam (mutaci\u00f3n asociada a transcripci\u00f3n) y tar (recombinaci\u00f3n asociada a transcripci\u00f3n) (aguilera, 2002). No obstante y a pesar de su universalidad, la bases moleculares de tam y tar no est\u00e1n del todo claras. para explicar c\u00f3mo la transcripci\u00f3n estimula la inestabilidad de una determinada secuencia es importante tener en cuenta que el adn es m\u00e1s inestable cuando se encuentra en forma de cadena sencilla (lindahl, 1993), ya que durante el proceso de la elongaci\u00f3n transcripcional se generan cambios topol\u00f3gicos, como la acumulaci\u00f3n de superenrrollamiento negativo, y reordenaciones en la cromatina que pueden dar lugar de manera transitoria a regiones de adn en forma de cadena sencilla (kim et al., 2007; schmidt et al., 2006), m\u00e1s susceptible de recombinar y mutar. De hecho, los efectos de la transcripci\u00f3n sobre la recombinaci\u00f3n en s. Cerevisiae aumentan de forma sin\u00e9rgica con la inducci\u00f3n de da\u00f1os producidos por agentes qu\u00edmicos (garcia-rubio et al., 2003).  sin embargo, parece que la mayor accesibilidad de la mol\u00e9cula de adn durante su transcripci\u00f3n no es la \u00fanica causa de tar. Se ha propuesto que la transcripci\u00f3n puede frenar o incluso bloquear el paso de las horquillas de replicaci\u00f3n. El bloqueo de la replicaci\u00f3n puede derivar en el colapso de las horquillas, el desensamblaje del replisoma, y la generaci\u00f3n de roturas en el adn que requieren de la maquinaria de recombinaci\u00f3n para su reparaci\u00f3n (lopes et al., 2001; sogo et al., 2002; tercero and diffley, 2001). De hecho, se ha descrito c\u00f3mo la replicaci\u00f3n se ralentiza y puede llegar a colapsar en genes trascritos por las arn polimerasas i, ii y iii (deshpande and newlon, 1996; prado and aguilera, 2005; takeuchi et al., 2003). Esta situaci\u00f3n es m\u00e1s evidente en ausencia de la helicasa rrm3 (ivessa et al., 2003; prado and aguilera, 2005), lo que indica que existen mecanismos activos, como esta helicasa, para que la replicaci\u00f3n pueda superar los obst\u00e1culos presentes en el adn tales como la arn polimerasa transcribiendo.   De hecho, experimentos de chip on chip han demostrado que rrm3 se encuentra en todos los genes que se transcriben (azvolinsky et al., 2006) lo que apoya esta idea de que la transcripci\u00f3n constituye un obst\u00e1culo para la replicaci\u00f3n. En la misma l\u00ednea, estudios gen\u00e9ticos demuestran que tar ocurre s\u00f3lo en la fase s del ciclo celular (prado and aguilera, 2005), mientras que la frecuencia de tam no se ve afectada por la replicaci\u00f3n (kim et al., 2007).  la elongaci\u00f3n de la transcripci\u00f3n en eucariotas est\u00e1 acoplada a una serie de pasos del procesamiento del arnm naciente para formar la ribonucleopart\u00edcula proteica (mrnp) y su transporte del n\u00facleo al citoplasma a trav\u00e9s del poro nuclear (aguilera, 2005; keene, 2007). Mutaciones en los genes implicados en la conexi\u00f3n de estos procesos generan una fuerte tar (fan et al., 2001; gallardo et al., 2003; luna et al., 2005; prado et al., 1997). El caso m\u00e1s estudiado lo encontramos en los mutantes del complejo tho, en los que se da una fuerte hiper-recombinaci\u00f3n asociada a transcripci\u00f3n.  el complejo tho est\u00e1 formado por las prote\u00ednas tho2, hpr1, mft1 y thp2 y funciona en la interfase transcripci\u00f3n-transporte del arnm mediante su interacci\u00f3n con la atpasa dependiente de arn sub2 y la prote\u00edna de uni\u00f3n a arn yra1. Todas estas prote\u00ednas forman un macrocomplejo conocido como trex (chavez et al., 2000; strasser et al., 2002). Los mutantes del complejo tho comparten fenotipos de defectos en elongaci\u00f3n de la transcripci\u00f3n y en el transporte de arnm al citoplasma junto a la citada fuerte hiper-recombinaci\u00f3n dependiente de transcripci\u00f3n, lo que se ha observado principalmente en genes largos y de alto contenido en gc o con m\u00faltiples repeticiones internas  (chavez et al., 2001; voynov et al., 2006). El origen de la fuerte tar de los mutantes tho no est\u00e1 del todo claro pero se ha relacionado tanto con la formaci\u00f3n co-transcripcional de un r-loop como con la obstaculizaci\u00f3n de la replicaci\u00f3n. en los mutantes tho el arnm no se ensambla de manera correcta ni interacciona bien con las prote\u00ednas responsables de su posterior transporte al citoplasma, lo que promueve la formaci\u00f3n co-transcripcional de un r-loop, en el que el arnm naciente forma un h\u00edbrido m\u00e1s o menos estable con la cadena no transcrita, que ha sido descrito como responsable de la hiper-recombinaci\u00f3n (huertas and aguilera, 2003). De manera similar, se ha descrito una conexi\u00f3n entre la formaci\u00f3n de r-loops y la inestabilidad gen\u00e9tica en mutantes en el complejo de splicing asf\/sf2 de c\u00e9lulas de pollo y humanas (li and manley, 2005). Por otra parte, los mutantes tho  provocan una disminuci\u00f3n en la velocidad de las horquillas de replicaci\u00f3n, que tambi\u00e9n ha sido propuesto como causa de la fuerte tar observada (wellinger et al., 2006).  Sin embargo, no se conoce si existe conexi\u00f3n entre la formaci\u00f3n del r-loop y los problemas que se generan durante replicaci\u00f3n en los mutantes tho. el objetivo principal de la investigaci\u00f3n desarrollada durante esta tesis ha consistido en profundizar en el conocimiento de las causas que originan la inestabilidad gen\u00e9tica asociada a transcripci\u00f3n. Particularmente, hemos trabajado con distintos mutantes en el complejo tho, en los que se han descrito fenotipos de alta inestabilidad asociada a transcripci\u00f3n. Para ello, hemos desarrollado nuevos sistemas gen\u00e9ticos capaces de medir la frecuencia de mutaci\u00f3n y recombinaci\u00f3n en distintas condiciones de transcripci\u00f3n y en distintos fondos mutantes en la levadura s. Cerevisiae.  de una parte, para tratar de entender el porqu\u00e9 de la actuaci\u00f3n de aid en ciertas secuencias y no otras, hemos estudiado las consecuencias de la expresi\u00f3n heter\u00f3loga de la prote\u00edna humana aid en la levadura. Dado que se ha visto que en las regiones s de los genes de las inmunoglobulinas se forman h\u00edbridos adn-arn que parecen estar implicados en la especialidad de acci\u00f3n de aid, y que los mutantes tho de la levadura facilitan la formaci\u00f3n de estos h\u00edbridos durante la transcripci\u00f3n, nos preguntamos si la acci\u00f3n de aid podr\u00eda estar facilitada en dichos mutantes, de manera que pudi\u00e9semos imitar  en la levadura la situaci\u00f3n que en realidad ocurre en c\u00e9lulas b. As\u00ed, hemos observado como la expresi\u00f3n heter\u00f3loga de la prote\u00edna humana aid en s. Cerevisiae induce un aumento de las frecuencias de mutaci\u00f3n y recombinaci\u00f3n de manera dependiente de transcripci\u00f3n. Adem\u00e1s, tanto la hiper-mutaci\u00f3n como la hiper-recombinaci\u00f3n inducidas por aid aumentan de manera sin\u00e9rgica en mutantes del complejo tho y otras prote\u00ednas relacionadas, como thp1. La caracterizaci\u00f3n molecular del tipo de mutaciones originadas ha desvelado que aid act\u00faa preferentemente en la cadena no transcrita del adn, lo que apoya la teor\u00eda de que el h\u00edbrido adn-arn que se forma en dichos mutantes favorece la acci\u00f3n de aid.  con objeto de estudiar el posible papel de los h\u00edbridos adn-arn como obst\u00e1culo para la replicaci\u00f3n y sus implicaciones en tar, hemos utilizado el mutante puntual hpr1-101, que comparte con los otros mutantes tho el fuerte defecto transcripcional, si bien no presenta un fenotipo de hiper-recombinaci\u00f3n asociada a transcripci\u00f3n (huertas et al., 2006). Es, por tanto, el primer caso en el que se separan los fenotipos de trancripci\u00f3n e hiper-recombinaci\u00f3n. El an\u00e1lisis de la frecuencia de mutaci\u00f3n nos ha revelado que la expresi\u00f3n de aid a\u00fan tiene efecto hiper-recombinador e hiper-mutador en hpr1-101, aunque el an\u00e1lisis de las mutaciones obtenidas indica que act\u00faa en ambas cadenas (transcrita y no transcrita), lo que muestra que en hpr1-101 no se generan h\u00edbridos adn-arn. Esto implica que defectos en el procesamiento del arnm pueden generar una acumulaci\u00f3n de superenrrollamiento tras la arn polimerasa responsable de una mayor accesibilidad del adn a aid sin que exista un h\u00edbrido adn-arn. Adem\u00e1s, dado que la replicaci\u00f3n se ve obstaculizada en los mutantes tho y no en hpr1-101 (huertas et al., 2006), podemos concluir que el r-loop es la causa de dicha obstaculizaci\u00f3n de la replicaci\u00f3n. adem\u00e1s, para entender el papel que la replicaci\u00f3n tiene en el origen de tam y tar, concretamente en los mutantes tho, hemos buscado posibles interacciones gen\u00e9ticas de tho, con una bater\u00eda de mutantes en genes involucrados en los procesos de replicaci\u00f3n, puntos de verificaci\u00f3n del ciclo (checkpoints), reparaci\u00f3n del adn  y remodelaci\u00f3n de la cromatina. De dicho an\u00e1lisis se concluye que la deleci\u00f3n de genes involucrados en el checkpoint de fase s como son rad24, mec1, rad53, ddc1, mec3 y rad17 provoca un defecto de crecimiento en los mutantes en el complejo tho. Dicho defecto es exacerbado en presencia de estr\u00e9s replicativo, de lo que se concluye que los genes implicados en el checkpoint de fase s son esenciales para la supervivencia de los mutantes tho en presencia de estr\u00e9s replicativo. Hemos observado que, en ausencia del checkpoint de fase s, las c\u00e9lulas mutantes en el complejo tho se acumulan en la fase g2 del ciclo, lo que parece mediado por el checkpoint mit\u00f3tico.  Es m\u00e1s, los dobles mutantes en tho y dichos factores de checkpoint de fase s presentan altos niveles de inestabilidad gen\u00e9tica. Esta se ha medido como focos de reparaci\u00f3n, hiper-recombinaci\u00f3n o tasa de reordenamientos cromos\u00f3micos, probablemente como consecuencia de su papel en el mantenimiento de la estabilidad de las horquillas de replicaci\u00f3n. por \u00faltimo, el an\u00e1lisis de la replicaci\u00f3n en un gen cromos\u00f3mico de alta transcripci\u00f3n mediante la t\u00e9cnica de geles bidimensionales de adn nos ha revelado que en los mutantes tho existe una acumulaci\u00f3n de intermediarios replicativos. Estos resultados concuerdan con los datos previamente publicados en los que se describi\u00f3 en un sistema plasm\u00eddico un defecto en replicaci\u00f3n asociado a transcripci\u00f3n en los mutantes tho (wellinger et al., 2006) y prueba que, de manera general, la transcripci\u00f3n genera problemas replicativos en ausencia del complejo tho. como modelo general podemos decir que el correcto funcionamiento de la transcripci\u00f3n  evita la acumulaci\u00f3n de superenrrollamiento negativo tras la arn polimerasa que favorecer\u00eda la formaci\u00f3n de regiones de adn de cadena sencilla, m\u00e1s susceptible de ser mutada o atacada por metabolitos internos o enzimas potencialmente mutag\u00e9nicas. Adem\u00e1s, el procesamiento co-transcripcional del arnm naciente tiene un papel en el mantenimiento de la estabilidad gen\u00e9tica, ya que evita la formaci\u00f3n de h\u00edbridos adn-arn. Estos h\u00edbridos no s\u00f3lo favorecen la formaci\u00f3n de regiones de adn de cadena sencilla en la cadena transcrita, sino que adem\u00e1s constituyen un obst\u00e1culo para la progresi\u00f3n de las horquillas replicativas. La colisi\u00f3n de la replicaci\u00f3n con los h\u00edbridos adn-arn generar\u00edan estructuras que desencadenan la activaci\u00f3n de los checkpoints, lo que es esencial para el mantenimiento de las horquillas y la supervivencia celular.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Inestabilidad gen\u00e9tica asociada a transcripci\u00f3n<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Inestabilidad gen\u00e9tica asociada a transcripci\u00f3n <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Bel\u00e9n G\u00f3mez Gonz\u00e1lez <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Sevilla<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 05\/03\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Andr\u00e9s Aguilera L\u00f3pez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: josep Casadesus pursals <\/li>\n<li>carlo vito Bruschi (vocal)<\/li>\n<li>charles White (vocal)<\/li>\n<li>almudena Rodr\u00edguez ramiro (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Bel\u00e9n G\u00f3mez Gonz\u00e1lez Durante el metabolismo del adn tienen lugar diversos procesos, como son la replicaci\u00f3n, transcripci\u00f3n [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center 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