{"id":92101,"date":"2009-06-03T00:00:00","date_gmt":"2009-06-03T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/amphipathic-proline-rich-cell-penetrating-peptides-fron-development-to-cargo-transport\/"},"modified":"2009-06-03T00:00:00","modified_gmt":"2009-06-03T00:00:00","slug":"amphipathic-proline-rich-cell-penetrating-peptides-fron-development-to-cargo-transport","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/barcelona\/amphipathic-proline-rich-cell-penetrating-peptides-fron-development-to-cargo-transport\/","title":{"rendered":"Amphipathic proline-rich cell-penetrating peptides: fron development to cargo transport"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Silvia Pujals Riat\u00f3s <\/strong><\/h2>\n<p>El desarrollo de f\u00e1rmacos exitosos implica muchos pasos, el m\u00e1s importante de los cuales es asegurar que el candidato a f\u00e1rmaco interaccione eficientemente con su diana. Una vez este hecho se consigue, se tienen que mejorar otros aspectos, como la selectividad, la estabilidad, la eliminaci\u00f3n y la liberaci\u00f3n. Para dianas localizadas en el interior celular, conseguir una liberaci\u00f3n intracelular del f\u00e1rmaco es crucial. Desafortunadamente, la mayor\u00eda de los candidatos a f\u00e1rmaco son incapaces de cruzar la membrana citoplasm\u00e1tica. Una estrategia para transportar f\u00e1rmacos dentro de la c\u00e9lula es la utilizaci\u00f3n de secuencias pept\u00eddicas con la capacidad de translocar la membrana citoplasm\u00e1tica. Esta estrategia surgi\u00f3 en 1994, con el descubrimiento que la tercera h\u00e9lice del homeodominio de la antennapedia, pantp(43-58), pod\u00eda cruzar la membrana celular. Desde entonces, se han descubierto diferentes p\u00e9ptidos con esta capacidad, nombrados p\u00e9ptidos lanzadera (en ingl\u00e9s \u00abcell-penetrating peptides\u00bb, \u00abcpps\u00bb). En el presente trabajo se han utilizado una familia de p\u00e9ptidos lanzadera introducidos en el laboratorio del prof. Giralt: los p\u00e9ptidos amfip\u00e1ticos ricos en prolina. El mejor candidato como p\u00e9ptido lanzadera de esta familia fue el tr\u00edmero de arginina, cf-(vrlppp)3 (nombrado \u00absweet arrow peptide\u00bb, sap). Las grandes ventajas de estos nuevos p\u00e9ptidos son su origen no viral, su elevada solubilidad en agua y la ausencia de citotoxicidad hasta concentraciones tan elevadas como 1 mm. se optimiz\u00f3 la estabilidad metab\u00f3lica del p\u00e9ptido lanzadera, partiendo de la secuencia de sap el nuevo derivado resistente a proteasas se consigui\u00f3 mediante la s\u00edntesis con amino\u00e1cidos d, una configuraci\u00f3n no susceptible a la degradaci\u00f3n por proteasas. El p\u00e9ptido lanzadera con amino\u00e1cidos d se internaliza en c\u00e9lulas al mismo nivel que la versi\u00f3n con amino\u00e1cidos l, de manera que se puede concluir que el mecanismo de internalizaci\u00f3n es independiente de receptor. Se ha comprobado la mayor estabilidad metab\u00f3lica del p\u00e9ptido con amino\u00e1cidos d, resultando ser completamente resistente a elevadas concentraciones de tripsina y frente a un 90% de suero humano. Contrariamente, el p\u00e9ptido con amino\u00e1cidos l se degrada r\u00e1pidamente. la estructura secundaria de los p\u00e9ptidos se ha estudiado mediante dicro\u00edsmo circular, confirmando la predicha estructura de poliprolina ii. Adem\u00e1s, estudiando los p\u00e9ptidos a distintas concentraciones se ha observado un comportamiento agregativo, pues a mayor concentraci\u00f3n la elipticidad molar por residuo aumenta, hasta llegar a un punto (50 \u00c2\u00bfm) donde esta permanece constante. Se han estudiado mediante microscopia de transferencia electr\u00f3nica las estructuras de estos agregados, trat\u00e1ndose de fibras de unos 16 (\u00c2\u00b13) nm de amplitud y de alargada variable. adem\u00e1s se han realizado experimentos de internalizaci\u00f3n a 4 \u00c2\u00b0c y con inhibidores de la producci\u00f3n de atp, viendo que el nivel de internalizaci\u00f3n disminuye considerablemente con su presencia. Estos resultados apuntan hacia un mecanismo de tipo endoc\u00edtico, de manera que se han realizado estudios de colocalizaci\u00f3n para saber de qu\u00e9 tipo de endocitosis se trata. As\u00ed, se ha trabajado con dos prote\u00ednas cuyo mecanismo de internalizaci\u00f3n es conocido, la colera toxina, cuya internalizaci\u00f3n se da por endocitosis v\u00eda caveolas o lipid-rafts, y la transferrina, cuya internalizaci\u00f3n se da por endocitosis v\u00eda clatrinas: se ha comprobado que el p\u00e9ptido colocaliza con la colera toxina, es decir, que su ruta de internalizaci\u00f3n es v\u00eda caveolas o lipid-rafts. se escogi\u00f3 como cargo para sap nanopart\u00edculas de oro, por su potencial aplicaci\u00f3n en biotecnolog\u00eda y sus excelentes propiedades \u00f3pticas. Se han sintetizado np au, se les ha conjugado el p\u00e9ptido con una ciste\u00edna en n-t y se han caracterizado mediante distintas t\u00e9cnicas: espectroscopia visible, microscopia electr\u00f3nica de transmisi\u00f3n, xps, hrtem-eels, potencial zeta y dls. Despu\u00e9s se ha comprobado el transporte de las np au mediado por el p\u00e9ptido lanzadera en c\u00e9lulas hela por microscop\u00eda electr\u00f3nica de transmisi\u00f3n, microscop\u00eda confocal de escaneo con l\u00e1ser y microscop\u00eda de rayos x de transmisi\u00f3n. En todos los casos se ha observado una clara internalizaci\u00f3n de las nanopart\u00edculas de oro, mientras que \u00e9stas sin p\u00e9ptido conjugado no son transportadas dentro de la c\u00e9lula. Se han realizado estudios de viabilidad a las 2 y 24h de incubaci\u00f3n y en ambos casos la viabilidad ha sido superior al 90%, indicando que el tratamiento con nanopart\u00edculas no es t\u00f3xico. Por otro lado, en colaboraci\u00f3n con el grupo de nanobiosensores de la universidad aut\u00f3noma de barcelona, se ha conjugado el p\u00e9ptido lanzadera a \u00abquantum dots\u00bb, puntos cu\u00e1nticos, nanopart\u00edculas de sulfuro de cadmio con propiedades fluorescentes. Se han caracterizado los \u00abquantum dots\u00bb unidos al p\u00e9ptido lanzadera mediante la medida del potencial zeta y con espectros de fluorescencia. Posteriormente se ha evaluado la internalizaci\u00f3n de los quantum dots con o sin p\u00e9ptido lanzadera en su superficie mediante microscop\u00eda confocal, pudiendo confirmar que la presencia del p\u00e9ptido es clave para la internalizaci\u00f3n de los \u00abquantum dots\u00bb. Finalmente se ha podido cuantificar la presencia de los quantum dots por detecci\u00f3n electroqu\u00edmica del cadmio mediante \u00abscreen-printed electrodes\u00bb.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Amphipathic proline-rich cell-penetrating peptides: fron development to cargo transport<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Amphipathic proline-rich cell-penetrating peptides: fron development to cargo transport <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Silvia Pujals Riat\u00f3s <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Barcelona<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 06\/03\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Ernest Giralt Lledo<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Antonio Planas sauter <\/li>\n<li>florine Cavelier (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<li>  (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Silvia Pujals Riat\u00f3s El desarrollo de f\u00e1rmacos exitosos implica muchos pasos, el m\u00e1s importante de los cuales 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