{"id":93347,"date":"2018-03-11T10:12:43","date_gmt":"2018-03-11T10:12:43","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/dna-mitocondrial-de-la-variabilidad-poblacional-a-las-mutaciones-patologicas\/"},"modified":"2018-03-11T10:12:43","modified_gmt":"2018-03-11T10:12:43","slug":"dna-mitocondrial-de-la-variabilidad-poblacional-a-las-mutaciones-patologicas","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/acidos-nucleicos\/dna-mitocondrial-de-la-variabilidad-poblacional-a-las-mutaciones-patologicas\/","title":{"rendered":"Dna mitocondrial: de la variabilidad poblacional a las mutaciones patol\u00f3gicas"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Raquel Moreno Loshuertos <\/strong><\/h2>\n<p>En los \u00faltimos a\u00f1os se han identificado gran cantidad de mutaciones puntuales y deleciones mtdna que causan enfermedades humanas. Estas mutaciones se han asociado a un amplio espectro de manifestaciones cl\u00ednicas que cursan mayoritariamente con disfunciones neurol\u00f3gicas degenerativas, incluyendo ceguera, sordera, demencia, des\u00f3rdenes del movimiento, ataxia, y encefalopat\u00edas en general. Adem\u00e1s de las mutaciones patol\u00f3gicas, se han descrito numerosas variantes polim\u00f3rficas del mtdna que se han considerado inicialmente como sustituciones neutras producto de la evoluci\u00f3n y que se generan y fijan en lugares geogr\u00e1ficos determinados. Desde hace alg\u00fan tiempo, algunas de estas variantes han dejado de considerarse neutras puesto que, si bien no producen patolog\u00edas por s\u00ed mismas, s\u00ed parecen tener consecuencias fenot\u00edpicas. As\u00ed, se han asociado con determinados fenotipos como la longevidad, la motilidad esperm\u00e1tica, la adaptaci\u00f3n al fr\u00edo e incluso con distintos grados de susceptibilidad o penetrancia de enfermedades mitocondriales o en las que la mitocondria juega un papel importante. Aunque la capacidad de detecci\u00f3n y diagn\u00f3stico de alteraciones en el mtdna ha progresado r\u00e1pidamente, no existe todav\u00eda tratamiento para estas enfermedades, debido, principalmente a la falta de comprensi\u00f3n de los mecanismos moleculares que relacionan determinada mutaci\u00f3n con un fenotipo.   el estudio de los mecanismos moleculares de las enfermedades asociadas a mutaciones en el mtdna s\u00f3lo se ha podido realizar en modelos celulares de dichas patolog\u00edas. El desarrollo de modelos animales, imprescindible para comprender estas enfermedades y abordar estrategias terap\u00e9uticas, se ha visto dificultado por diversas barreras t\u00e9cnicas. Entre ellas destaca la imposibilidad de transformar mitocondrias con dna ex\u00f3geno, lo que ha impedido el dise\u00f1o de t\u00e9cnicas de mutag\u00e9nesis dirigida que ayuden a imitar las mutaciones observadas en humanos. Este hecho, unido a la ausencia de mutaciones naturales en rat\u00f3n y a la barrera interespec\u00edfica, que no permite utilizar mitocondrias obtenidas de pacientes humanos en modelos animales, ha dificultado la generaci\u00f3n de estas herramientas. Recientemente, sin embargo, se ha publicado la generaci\u00f3n de los primeros ratones portadores de mutaciones en su mtdna, mediante transferencia a embriones de mitocondrias provenientes de una l\u00ednea celular inmortalizada con mutaciones preexistentes en su mtdna.  en nuestro grupo, se ha desarrollado un m\u00e9todo de generaci\u00f3n y selecci\u00f3n de mutaciones aleatorias en el mtdna de c\u00e9lulas de rat\u00f3n en cultivo y se han obtenido mutaciones en distintos genes mitocondriales que servir\u00e1n como material de partida para la generaci\u00f3n de modelos animales de enfermedades provocadas por alteraciones en el mtdna.  el principal objetivo de este trabajo ha sido descifrar tanto los mecanismos moleculares de patogenicidad de las alteraciones en el mtdna como descubrir las implicaciones funcionales de las variantes polim\u00f3rficas del mismo, las v\u00edas de ensamblaje de los distintos complejos y la regulaci\u00f3n del sistema oxphos. Por este motivo se ha dividido en dos grandes apartados: variabilidad poblacional y mutaciones patol\u00f3gicas.  i. Variabilidad poblacional:   este primer apartado constituye el esfuerzo de comprender las asociaciones entre snps (single nucleotide polymorphisms) mitocondriales con diversos fenotipos y se presenta como un recorrido desde las variantes polim\u00f3rficas neutras hasta aqu\u00e9llas que, sin ser patol\u00f3gicas per se, parecen predisponer  a la aparici\u00f3n de enfermedades.  a) variantes polim\u00f3rficas neutras:  con la finalidad de explicar las diferencias fenot\u00edpicas observadas en ratones portadores de diferentes variantes de mtdna y estudiar la implicaci\u00f3n de estos factores gen\u00e9ticos en la funci\u00f3n oxphos as\u00ed como su influencia en la respuesta a f\u00e1rmacos o factores ambientales, hemos analizado la funci\u00f3n mitocondrial de l\u00edneas celulares portadoras de distintas variantes de mtdna en un mismo entorno nuclear.   as\u00ed, hemos confirmado que las variantes no patol\u00f3gicas del mtdna de rat\u00f3n que parecen predisponer a menor capacidad de aprendizaje  o que potencian fenotipos de sordera en combinaci\u00f3n con mutaciones en el genoma nuclear, tienen una capacidad respiratoria similar a otras variantes. Sin embargo, hemos puesto de manifiesto que esta similitud en funci\u00f3n oxphos, esconde variaciones en la eficiencia de la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial que se revelan como diferencias en la producci\u00f3n de h2o2, disminuci\u00f3n de la actividad de enzimas del ciclo de krebs sensibles a ros (aconitasa y a-kgdh) y aumento de la actividad de las enzimas encargadas de su detoxificaci\u00f3n (catalasa y mnsod). Estas observaciones quedan validadas por el efecto de los scavengers de ros (nac y tiron) sobre la capacidad oxphos, la biog\u00e9nesis mitocondrial y el crecimiento en galactosa. Adem\u00e1s hemos identificado como causa gen\u00e9tica responsable de estas diferencias funcionales, la variaci\u00f3n en longitud de un track de nucle\u00f3tidos de adenina en el gen mt-tr que var\u00eda entre 8 y 10 (\u00f3 9a + 1t) y provoca que el tama\u00f1o del bucle dhu del trna maduro var\u00ede entre 5 y 7 nucle\u00f3tidos y, como causa molecular, la disminuci\u00f3n moderada de la tasa de s\u00edntesis de prote\u00ednas mitocondriales que s\u00f3lo se manifiesta cuando tratamos las c\u00e9lulas con compuestos que la inhiben espec\u00edficamente.   b) variantes gen\u00e9ticas con efectos funcionales moderados:  dentro del grupo de enfermedades que presentan cierta asociaci\u00f3n con variantes gen\u00e9ticas mitocondriales se encuentran procesos tan complejos como el c\u00e1ncer , la esclerosis m\u00faltiple , el parkinson  o el alzheimer.  en nuestro an\u00e1lisis nos hemos interesado en la evaluaci\u00f3n de la implicaci\u00f3n del mtdna como marcador activo del proceso de formaci\u00f3n de tumores por lo que hemos buscado variantes gen\u00e9ticas mitocondriales mediante secuenciaci\u00f3n completa del mtdna de 13 l\u00edneas celulares derivadas de c\u00e1nceres humanos. Una vez filtrados todos los polimorfismos conocidos del mtdna, se identificaron varias mutaciones que pod\u00edan tener una relevancia especial. Tras buscar la presencia de estas modificaciones en biopsias de tumores procedentes de pacientes de c\u00e1ncer y caracterizarlas bioqu\u00edmicamente en c\u00edbridos transmitocondriales, se encontraron dos mutaciones en el mtdna funcionalmente relevantes: una mutaci\u00f3n nueva, localizada en el gen de mt-ts2 (m.12440delc), y un cambio recurrente en el gen mt-co1 (m.6267 g>a), presente en tumores (3\/387) as\u00ed como en varias l\u00edneas celulares tumorales (3\/13) y en muestras de dna de tejido no tumoral de pacientes con c\u00e1ncer y pr\u00e1cticamente ausente en controles (1\/2264).   hemos demostrado que la mutaci\u00f3n en mt-co1 provoca una alteraci\u00f3n en la funci\u00f3n oxphos que se manifiesta como disminuci\u00f3n de la actividad cox, se asocia espec\u00edficamente con c\u00e1ncer y presenta frecuencias similares a mutaciones patol\u00f3gicas del mtdna. Al igual que otras mutaciones mitocondriales, aparece de manera recurrente y se encuentra en 5 haplogrupos diferentes, indicando eventos de mutaci\u00f3n diferentes. Adem\u00e1s, se ha encontrado en muestras de tejido no tumoral de los pacientes que presentaban el tumor, lo que sugerir\u00eda que se trata de una mutaci\u00f3n que favorecer\u00eda el desarrollo del c\u00e1ncer.   ii. Mutaciones patol\u00f3gicas:  a) mutaciones patol\u00f3gicas con distinta penetrancia:  casi la mitad de las m\u00e1s de 250 mutaciones descritas en el mtdna humano, se encuentran en genes que codifican trnas y en todos ellos han aparecido sustituciones en, al menos, una posici\u00f3n. Sin embargo, hasta la fecha no se han descrito mutaciones en genes mitocondriales que afecten a la s\u00edntesis de prote\u00ednas en rat\u00f3n.  mediante mutag\u00e9nesis aleatoria y selecci\u00f3n positiva, hemos generado y caracterizado el primer mutante en un trna mitocondrial en c\u00e9lulas de rat\u00f3n, concretamente en la posici\u00f3n 3739, en el gen del mt-ti, y se localiza en el bucle del anticod\u00f3n del trna en una zona altamente conservada a lo largo de la evoluci\u00f3n. Como corresponde a mutantes en trnas, la l\u00ednea celular presenta un fenotipo oxphos defectuoso con afectaci\u00f3n de todos los complejos, especialmente el i y el iv as\u00ed como reducci\u00f3n de la capacidad de crecimiento en medio de galactosa. Aunque la disminuci\u00f3n de la cantidad de trna en el estado estacionario no es demasiado acusada, s\u00ed que hemos encontrado alteraciones en el patr\u00f3n de aminoacilaci\u00f3n del trna mutado que nos hacen sospechar la aparici\u00f3n de una estructura secundaria del trna que no es reconocida por la isoleucil-trna sintetasa, disminuyendo de este modo, la cantidad de trna apto para la s\u00edntesis de prote\u00ednas. Del mismo modo, hemos observado una reducci\u00f3n moderada de la s\u00edntesis de prote\u00ednas mitocondriales que, s\u00f3lo se revela cuando se tratan las c\u00e9lulas con inhibidores espec\u00edficos como el cloranfenicol o la pentamidina, y que parece afectar a la estabilidad de los complejos respiratorios que dependen de subunidades codificadas en el mtdna. Cuando estudiamos una mutaci\u00f3n patol\u00f3gica similar, encontrada en pacientes humanos, observamos un patr\u00f3n de aminoacilaci\u00f3n y un d\u00e9ficit en la s\u00edntesis de prote\u00ednas mitocondriales an\u00e1logo al descrito en rat\u00f3n.   b) mecanismos de competencia entre complejos del sistema oxphos:  el otro tema que se ha desarrollado en esta tesis ha sido el an\u00e1lisis detallado de la biog\u00e9nesis del sistema de la cadena de transporte electr\u00f3nico y, en concreto, el estudio de la asociaci\u00f3n y dependencia entre distintos complejos de la cadena de transporte electr\u00f3nico con el fin de optimizar el proceso de fosforilaci\u00f3n oxidativa.  con el objetivo de hallar fenotipos de supresi\u00f3n de la mutaci\u00f3n patol\u00f3gica en el gen mt-cytb (m.15263g>a) que provoca un cambio de amino\u00e1cido que impide su plegamiento, el ensamblaje del complejo iii y la estabilizaci\u00f3n del i, la sometimos a mutag\u00e9nesis aleatoria y selecci\u00f3n positiva y encontramos un modelo muy interesante de competencia entre complejos, concretamente entre los complejos i y ii, por asociarse al complejo iii.  el car\u00e1cter supresor del fenotipo mutante que presentaba la nueva l\u00ednea celular (ma22) se demostr\u00f3 mediante la recuperaci\u00f3n parcial tanto del ensamblaje como de la actividad de los complejos i y iii. La caracterizaci\u00f3n de la l\u00ednea supresora nos indic\u00f3 que, una peque\u00f1a cantidad de complejo iii ensamblado era suficiente para permitir la estabilizaci\u00f3n del 60% del complejo i consiguiendo una actividad espec\u00edfica igual al 50% de del control. Adem\u00e1s, se observ\u00f3 un aumento significativo en la eficiencia de la ubiquinona para recibir electrones desde el complejo i, as\u00ed como la disminuci\u00f3n de eficiencia en la recepci\u00f3n de electrones provenientes de otras enzimas distintas del complejo i.   el aumento del supercomplejo i+iii de la l\u00ednea celular ma22 podr\u00eda explicarse como un mecanismo para aumentar la eficiencia de la cadena de transporte electr\u00f3nico, dado que el complejo iii es indispensable para la estabilizaci\u00f3n del complejo i y que se encuentra ensamblado en una proporci\u00f3n muy baja. Puesto que la energ\u00eda que se obtiene a trav\u00e9s del transporte de electrones desde el complejo i es mayor que la generada cuando la ubiquinona los recibe de la succinato deshidrogenasa, el complejo iii ser\u00eda secuestrado nada m\u00e1s ensamblarse por el complejo i, y no quedar\u00eda complejo iii libre para asociarse con otros complejos.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Dna mitocondrial: de la variabilidad poblacional a las mutaciones patol\u00f3gicas<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Dna mitocondrial: de la variabilidad poblacional a las mutaciones patol\u00f3gicas <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Raquel Moreno Loshuertos <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Zaragoza<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 18\/05\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Jos\u00e9 Antonio Enr\u00edquez Dom\u00ednguez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: manuel Lopez perez <\/li>\n<li>Santiago Lamas pel\u00e1ez (vocal)<\/li>\n<li>david Comas mart\u00ednez (vocal)<\/li>\n<li>jorgina Satr\u00fastegui gil-delgado (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Raquel Moreno Loshuertos En los \u00faltimos a\u00f1os se han identificado gran cantidad de mutaciones puntuales y deleciones 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