{"id":94849,"date":"2009-03-07T00:00:00","date_gmt":"2009-03-07T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/new-systems-and-new-factors-in-nuclear-and-mitochondrial-genomic-instability-in-yeast\/"},"modified":"2009-03-07T00:00:00","modified_gmt":"2009-03-07T00:00:00","slug":"new-systems-and-new-factors-in-nuclear-and-mitochondrial-genomic-instability-in-yeast","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/levaduras\/new-systems-and-new-factors-in-nuclear-and-mitochondrial-genomic-instability-in-yeast\/","title":{"rendered":"New systems and new factors in nuclear and mitochondrial genomic instability in yeast"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> M. Carmen Diaz De La Loza <\/strong><\/h2>\n<p>Introducci\u00f3n el adn est\u00e1 sometido a diferentes mecanismos para su replicaci\u00f3n y la expresi\u00f3n de la informaci\u00f3n contenida en la doble h\u00e9lice, as\u00ed como a una gran variedad de agentes da\u00f1inos, tanto ex\u00f3genos como producidos por el mismo metabolismo  celular (como puede ser el da\u00f1o oxidativo provocado en la mitocondria durante la respiraci\u00f3n). Para controlar estos procesos y reparar las posibles lesiones en el adn existen mecanismos que previenen o reparan dichas anomal\u00edas. el objetivo de esta tesis durante la duraci\u00f3n de la beca ha sido el estudio de distintos aspectos relacionados con el metabolismo del adn y la inestabilidad gen\u00e9tica. En este sentido se han desarrollado dos sistemas que nos permiten estudiar los mecanismos celulares para la protecci\u00f3n del material gen\u00e9tico.  hemos utilizado como organismo modelo de eucariotas la levadura saccharomyces cerevisiae. Cada uno de los sistemas aborda la distintos aspectos de la din\u00e1mica de toda la informaci\u00f3n gen\u00e9tica de la c\u00e9lula, contenida en dos compartimentos diferentes: el adn nuclear y el adn mitocondrial. en lo referente al posible efecto de la transcripci\u00f3n por parte de la polimerasa iii de arn hemos llevado a ensayos para determinar los niveles de recombinaci\u00f3n del adn, acompa\u00f1ados por el an\u00e1lisis de la replicaci\u00f3n mediante geles bidimensionales. Hemos construido un sistema de recombinaci\u00f3n plasm\u00eddico en el cual tenemos una versi\u00f3n del gen leu2 truncado con dos repeticiones directas(1), de manera que el trna sup53 se encuentra clonado entre ambas  repeticiones. La expresi\u00f3n del trna es constitutiva(2), y la frecuencia de recombinaci\u00f3n  puede  detectarse por la aparici\u00f3n de colonias que han recuperado la prototrof\u00eda para la leucina. La expresi\u00f3n del gen leu2 est\u00e1 regulada por el promotor gal1 para evitar la interferencia de la transcripci\u00f3n por la arn polimerasa ii. la transcripci\u00f3n del trna por la polimerasa iii se puede verificar por dos v\u00edas diferentes:  -visualizaci\u00f3n directa del arn mediante an\u00e1lisis de northern blot. -geles bidimensionales de adn: esta descrito que el locus del trna genera una pausa en la horquilla de replicaci\u00f3n cuando se transcribe activamente(2, 3). para incrementar el efecto de la transcripci\u00f3n del trna sup53 se realizaron estos an\u00e1lisis en el mutante nulo rrm3\u00c2\u00bf (4)ya que se ha descrito que la helicasa rrm3 es fundamental para permitir que la horquilla de replicaci\u00f3n supere barreras en el adn como pueden ser las \u00abreplication fork barriers(5)\u00bb y los trna(2).   antecedentes: 1.Estudio de la recombinaci\u00f3n inducida por la transcripci\u00f3n de la arn polimerasa iii. la arn polimerasa ii se encarga de la transcripci\u00f3n de los arn mensajeros y est\u00e1 ampliamente caracterizada. Adem\u00e1s de su funci\u00f3n como prote\u00edna de s\u00edntesis de arn, est\u00e1 descrito que su acci\u00f3n genera un ligero aumento de la inestabilidad gen\u00e9tica (monitorizado como un aumento en la frecuencia de recombinaci\u00f3n en diversos sistemas)(6) que se hace mucho m\u00e1s patente cuando se a\u00f1aden agentes da\u00f1inos del adn como puede ser el 4-nitroquinoline 1-oxide (4nqo)(7). la arn polimerasa iii se encarga de la transcripci\u00f3n de los arn transferente, arn ribos\u00f3mico de 5s y otros peque\u00f1os arn encontrados en el n\u00facleo celular y en el citoplasma. En esta tesis se ha construido un sistema que nos permite estudiar el efecto de la transcripci\u00f3n por la arn polimerasa iii del  mismo modo que se ha analizado para la polimerasa ii de arn(7). 2. Estudio de la inducci\u00f3n de da\u00f1o espec\u00edfico en el adn mitocondrial. la levadura s. Cerevisiae posee la capacidad de obtener energ\u00eda tanto mediante metabolismo respiratorio como fermentativo. Esto nos permite trabajar con c\u00e9lulas a las cuales se les ha eliminado la funci\u00f3n mitocondrial, por lo que podemos inducir da\u00f1o en el adn mitocondrial y analizar las consecuencias: activaci\u00f3n de v\u00edas de reparaci\u00f3n en la mitocondria, checkpoint. Etc.Para inducir da\u00f1o en la mitocondria se eligi\u00f3 un alelo mutante de la topoisomerasa i de adn (el alelo top1-103). La topoisomerasa i en condiciones silvestres tiene localizaci\u00f3n nuclear y act\u00faa modificando el enrollamiento del adn(8)). Su acci\u00f3n comienza con la generaci\u00f3n de un nick en el adn al que permanece unida temporalmente. En ciertas condiciones esta acci\u00f3n puede ser perjudicial para la c\u00e9lula, al formarse un complejo covalente entre la prote\u00edna y el adn que debe ser reparado. Esas condiciones incluyen la adici\u00f3n de drogas como la camptotecina(9) o ciertos mutantes de similar efecto(10), como es el alelo top1-103(11).  hip\u00f3tesis y objetivos 1.Estudio de la recombinaci\u00f3n inducida por la transcripci\u00f3n de la arn polimerasa iii. la transcripci\u00f3n del trna sup53 tiene un efecto en el aumento de la inestabilidad gen\u00e9tica que se ve ligeramente amplificado en presencia de drogas como el 4nqo. Dicho efecto es mucho m\u00e1s notable cuando se trabaja con el mutante rrm3\u00c2\u00bf, una helicasa que ayuda a superar barreras para la horquillad e replicaci\u00f3n. En este sentido, la pausa de la horquilla de replicaci\u00f3n (rfp) que con frecuencia localiza en el trna debe ser esencial para aumentar la inestabilidad del esa regi\u00f3n del genoma. 2. Estudio de la inducci\u00f3n de da\u00f1o espec\u00edfico en el adn mitocondrial. se ha generado un sistema que nos permite inducir un da\u00f1o espec\u00edfico en la mitocondria, que podemos visualizar mediante la localizaci\u00f3n de la prote\u00edna gfp, el an\u00e1lisis de la formaci\u00f3n de \u00abpetite\u00bb y la p\u00e9rdida de adn mitocondrial. As\u00ed mismo se ha observado que la camptotecina parece no tener un efecto en la prote\u00edna silvestre mitocondrial, lo cual indicar\u00eda que dicha droga no es capaz de penetrar en el interior de la mitocondria. en el futuro queremos llevar a cabo ensayos para caracterizar la reacci\u00f3n de la c\u00e9lula ante la inducci\u00f3n de da\u00f1o en el adn mitocondrial, definiendo con mas aproximaci\u00f3n el tipo de p\u00e9rdida mitocondrial que genera nuestra prote\u00edna y las v\u00edas de reparaci\u00f3n que act\u00faan ante este tipo de eventos, diferenci\u00e1ndolos de aquellas que act\u00faan en el n\u00facleo.  metodolog\u00eda y plan de trabajo respecto al material gen\u00e9tico nuclear se ha creado un sistema plasm\u00eddico que nos permite estudiar el efecto de la transcripci\u00f3n de la arn polimerasa iii (12) a trav\u00e9s del an\u00e1lisis de la frecuencia de recombinaci\u00f3n cuando un trna est\u00e1 siendo transcrito sin y con la presencia un agente da\u00f1ino para el adn. Si bien la maquinaria de reparaci\u00f3n nuclear se encuentra ampliamente caracterizada, las v\u00edas de reparaci\u00f3n del adn que act\u00faan en la mitocondria son a\u00fan desconocidas. Para poder profundizar mas en el mundo de la mitocondria hemos creado un sistema mediante el cual podemos dirigir una prote\u00edna mutada (11)genuinamente de  localizaci\u00f3n nuclear (la topoisomerasa i de adn(8)) de manera exclusiva a la mitocondria. Cuando se sobrexpresa dicha prote\u00edna mutada provoca la muerte celular al actuar en el n\u00facleo, sin embargo, en nuestro sistema, al dirigirlo a la mitocondria el da\u00f1o en el adn mitocondrial genera la p\u00e9rdida de funci\u00f3n mitocondrial, que puede visualizarse por la aparici\u00f3n de colonias\u00bbpetite\u00bb , de metabolismo fermentativo(13-15).  2. Estudio de la inducci\u00f3n de da\u00f1o espec\u00edfico en el adn mitocondrial. la levadura s. Cerevisiae posee la capacidad de obtener energ\u00eda tanto mediante metabolismo respiratorio como fermentativo. Esto nos permite trabajar con c\u00e9lulas a las cuales se les ha eliminado la funci\u00f3n mitocondrial, por lo que podemos inducir da\u00f1o en el adn mitocondrial y analizar las consecuencias: activaci\u00f3n de v\u00edas de reparaci\u00f3n en la mitocondria, checkpoint. Etc.Para inducir da\u00f1o en la mitocondria se eligi\u00f3 un alelo mutante de la topoisomerasa i de adn (el alelo top1-103). La topoisomerasa i en condiciones silvestres tiene localizaci\u00f3n nuclear y act\u00faa modificando el enrollamiento del adn(8)). Su acci\u00f3n comienza con la generaci\u00f3n de un nick en el adn al que permanece unida temporalmente. En ciertas condiciones esta acci\u00f3n puede ser perjudicial para la c\u00e9lula, al formarse un complejo covalente entre la prote\u00edna y el adn que debe ser reparado. Esas condiciones incluyen la adici\u00f3n de drogas como la camptotecina(9) o ciertos mutantes de similar efecto(10), como es el alelo top1-103(11). En este trabajo se ha construido una fusi\u00f3n de la topoisomerasa mutante top1-103 con una se\u00f1alizaci\u00f3n de localizaci\u00f3n mitocondria contenida en el gen sod2(16) y la prote\u00edna fluorescente gfp(17), que nos permite visualizar la localizaci\u00f3n de la prote\u00edna quimera. As\u00ed mismo se han construido diversos controles para confirma la actividad de nuestra prote\u00edna modificada. se han construido tambi\u00e9n versiones silvestres de la topoisomerasa para testar el efecto de la camptotecina en la mitocondria. de estas construcciones se ha analizado tanto la localizaci\u00f3n celular como el efecto en el crecimiento y la aparici\u00f3n de colonias\u00bbpetite\u00bb.  bibliograf\u00eda:  1.\tS. Chavez, a. Aguilera, genes dev 11, 3459 (dec 15, 1997). 2.\tA. M. Deshpande, c. S. Newlon, science 272, 1030 (may 17, 1996). 3.\tA. S. Ivessa et al., Mol cell 12, 1525 (dec, 2003). 4.\tA. Azvolinsky, s. Dunaway, j. Z. Torres, j. B. Bessler, v. A. Zakian, genes dev 20, 3104 (nov 15, 2006). 5.\tT. Kobayashi, t. Horiuchi, genes cells 1, 465 (may, 1996). 6.\tB. J. Thomas, r. Rothstein, cell 56, 619 (feb 24, 1989). 7.\tM. Garcia-rubio, p. Huertas, s. Gonzalez-barrera, a. Aguilera, genetics 165, 457 (oct, 2003). 8.\tJ. J. Champoux, annu rev biochem 70, 369 (2001). 9.\tM. A. Bjornsti, a. M. Knab, p. Benedetti, cancer chemother pharmacol 34 suppl, s1 (1994). 10.\tW. C. Colley, m. Van der merwe, j. R. Vance, a. B. Burgin, jr., M. A. Bjornsti, j biol chem 279, 54069 (dec 24, 2004). 11.\tD. Fink, s. Aebi, s. B. Howell, clin cancer res 4, 1 (jan, 1998). 12.\tA. P. Wolffe, curr opin cell biol 3, 461 (jun, 1991). 13.\tX. J. Chen, g. D. Clark-walker, int rev cytol 194, 197 (2000). 14.\tJ. Locker, a. Lewin, m. Rabinowitz, plasmid 2, 155 (apr, 1979). 15.\tG. Bernardi, gene 354, 189 (jul 18, 2005). 16.\tE. Luk, m. Yang, l. T. Jensen, y. Bourbonnais, v. C. Culotta, j biol chem 280, 22715 (jun 17, 2005). 17.\tR. Y. Tsien, annu rev biochem 67, 509 (1998).<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>New systems and new factors in nuclear and mitochondrial genomic instability in yeast<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 New systems and new factors in nuclear and mitochondrial genomic instability in yeast <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 M. Carmen Diaz De La Loza <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Sevilla<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 03\/07\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Andr\u00e9s Aguilera L\u00f3pez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: enrique Herrero perpi\u00f1an <\/li>\n<li>pablo Hern\u00e1ndez valenzuela (vocal)<\/li>\n<li>felipe Cortes benavides (vocal)<\/li>\n<li>Jos\u00e9 Antonio Tercero ordu\u00f1a (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de M. 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