{"id":95565,"date":"2018-03-11T10:15:36","date_gmt":"2018-03-11T10:15:36","guid":{"rendered":""},"modified":"2018-03-11T10:15:36","modified_gmt":"2018-03-11T10:15:36","slug":"valoracion-de-protocolos-de-diferenciacion-in-vitro-de-celulas-madre-embrionarias-de-raton-hacia-endodermo-pancreatico-mediante-el-analisis-de-poblaciones-celulares-que-expresan-marcadores-caractera","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/embriologia\/valoracion-de-protocolos-de-diferenciacion-in-vitro-de-celulas-madre-embrionarias-de-raton-hacia-endodermo-pancreatico-mediante-el-analisis-de-poblaciones-celulares-que-expresan-marcadores-caractera\/","title":{"rendered":"Valoraci\u00f3n de protocolos de diferenciaci\u00f3n in vitro de c\u00e9lulas madre embrionarias de rat\u00f3n hacia endodermo pancre\u00e1tico mediante el an\u00e1lisis de poblaciones celulares que expresan marcadores caracter\u00edsticos"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> N\u00e9stor Vicente Salar <\/strong><\/h2>\n<p>Transgenes, diferenciaci\u00f3n y selecci\u00f3n celular.  \tlos procesos de diferenciaci\u00f3n espont\u00e1neos en monocapa o en los cuerpos embrionarios en ausencia de lif son impredecibles, aunque existe una cierta tendencia en monocapa  hacia una mayor proporci\u00f3n de c\u00e9lulas de linaje ectod\u00e9rmico, lo que dificultar\u00eda la obtenci\u00f3n de precursores de otros linajes. Estudios anteriores han utilizado diferentes aproximaciones para la selecci\u00f3n de determinados precursores que pueden ser finalmente madurados a c\u00e9lulas diferenciadas, que remedan las funciones de las correspondientes de tejidos adultos: cardiomiocitos. Precursores neuronales, precursores hematopoy\u00e9ticos, osteoblastos. Nuestro laboratorio obtuvo varios clones de c\u00e9lulas productoras de insulina a partir de c\u00e9lulas embrionarias de rat\u00f3n de la l\u00ednea comercial r1, utilizando una tecnolog\u00eda de selecci\u00f3n mediante la expresi\u00f3n de un transgen, previamente incorporado en las c\u00e9lulas, conteniendo un factor de resistencia a neomicina (gating technology) bajo la regulaci\u00f3n del promotor de un gen expresado en las c\u00e9lulas  que queremos seleccionar, el promotor de la insulina en nuestro caso. Las c\u00e9lulas seleccionadas fueron maduradas de tal manera que fueron capaces de liberar insulina en respuesta a glucosa. Los clones implantados permitieron reducir los niveles de glucosa y la mortalidad de ratones diab\u00e9ticos. Uno de los principales inconvenientes de esta y de otras selecciones  es la baja proporci\u00f3n de clones que se obtienen, debido a que el n\u00famero de c\u00e9lulas precursoras que se obtienen en los procesos de diferenciaci\u00f3n son bajos. Uno de los principales objetivos de la ingenier\u00eda celular que persigue obtener tejidos de c\u00e9lulas embrionarias es la de favorecer los procesos de diferenciaci\u00f3n hacia linajes concretos que permita direccionar de una forma m\u00e1s efectiva la obtenci\u00f3n de c\u00e9lulas especializadas con potencial utilidad cl\u00ednica, desde neuronas, hasta c\u00e9lulas endocrinas. Es por ello imprescindible conocer los procesos de diferenciaci\u00f3n de estas c\u00e9lulas in vitro y los mecanismos que permiten su control.  una de las herramientas mas importantes utilizada recientemente en biolog\u00eda es la prote\u00edna verde fluorescente (gfp) clonada de medusas bioluminiscentes y que permite visualizar los procesos celulares y la expresi\u00f3n de prote\u00ednas. Este gen ha sido utilizado en diferentes construcciones gen\u00e9ticas bajo control de diferentes promotores cuya activaci\u00f3n puede ser seguida por la consiguiente expresi\u00f3n de la prote\u00edna y la emisi\u00f3n fluorescente. El objetivo de este trabajo es el de utilizar esta tecnolog\u00eda para estudiar el proceso de diferenciaci\u00f3n en l\u00edneas de c\u00e9lulas embrionarias de rat\u00f3n y poder seleccionar c\u00e9lulas precursoras de linaje endod\u00e9rmico capaz de madurar con alto rendimiento a c\u00e9lulas productoras de insulina.  para llevar a cabo este objetivo se ha iniciado recientemente el dise\u00f1o y la obtenci\u00f3n de un primer constructo para la selecci\u00f3n de c\u00e9lulas indiferenciadas conteniendo la gfp bajo el control del promotor del factor de transcripci\u00f3n denominado oct-4 que solo se expresa en las c\u00e9lulas indiferenciadas de la masa celular interna, as\u00ed como en las c\u00e9lulas precursoras de la l\u00ednea germinal. (Ku, h.T., Et al., 2004)  objetivos concretos antecedentes y metodolog\u00eda  el presente proyecto abarca tres objetivos relacionados con el proceso de diferenciaci\u00f3n in vitro de c\u00e9lulas embrionarias de rat\u00f3n, utilizando constructos conteniendo la prote\u00edna verde fluorescente como indicador as\u00ed como diferentes condicionantes en el cultivo in vitro que dirijan la diferenciaci\u00f3n hacia el endodermo definitivo, origen embrionario de las c\u00e9lulas productoras de insulina del p\u00e1ncreas (c\u00e9lula beta).   el primero pretende caracterizar m\u00e9todos de selecci\u00f3n de precursores de linaje endod\u00e9rmico definitivo, el segundo la selecci\u00f3n de c\u00e9lulas productoras de insulina mediante transgenes espec\u00edficos y el tercero pretende la identificaci\u00f3n de factores de diferenciaci\u00f3n en medios condicionados que puedan ayudar a una selecci\u00f3n m\u00e1s eficaz.  1.- Primer objetivo: estudio comparativo del proceso de diferenciaci\u00f3n con c\u00e9lulas en el mismo pase y de igual potencial te\u00f3rico, utilizando clones de c\u00e9lulas verdes indiferenciadas (alto contenido en oct-4) frente a clones sin fluorescencia correspondientes presumiblemente a c\u00e9lulas en proceso de diferenciaci\u00f3n cuyo linaje ya pueda estar condicionado. Este paso es crucial debido a la importancia que tienen las c\u00e9lulas residuales con alta expresi\u00f3n de oct-4 tras los procesos de diferenciaci\u00f3n, en terapia tisular, debido a que son las causantes de la producci\u00f3n de teratomas a causa de anomal\u00edas en el cariotipo, como hemos podido comprobar en nuestra unidad de investigaci\u00f3n. En vista de los interesantes resultados obtenidos se pas\u00f3 a publicar un art\u00edculo (ense\u00f1at-waser, r. Et al., 2006).  2.- Segundo objetivo: constructos de selecci\u00f3n de c\u00e9lulas productoras de hormonas pancre\u00e1ticas  el segundo objetivo concreto considerado es el de dise\u00f1ar, obtener y emplear construcciones gen\u00e9ticas conteniendo la proteina verde fluorescente o de resistencia a antibi\u00f3ticos bajo control de genes implicados en la aparici\u00f3n de c\u00e9lulas productoras de hormonas pancre\u00e1ticas, incluyendo el promotor de la propia insulina o glucag\u00f3n, as\u00ed como el promotor de genes que aparecen en el desarrollo temprano de c\u00e9lulas de endodermo definitivo como alfa-fetoproteina o tard\u00edo del p\u00e1ncreas endocrino como neurogenina-3. Aprovechando los resultados planteados en el primer objetivo se transfectar\u00e1n c\u00e9lulas con estas construcciones y se seleccionar\u00e1n clones (fluorescentes o resistentes) de c\u00e9lulas comprometidas hacia la diferenciaci\u00f3n de c\u00e9lulas de origen endod\u00e9rmico (alta expresi\u00f3n de alfa-fetoproteina). Los procesos de maduraci\u00f3n con nicotinamida o activina o de selecci\u00f3n coaxial con medios condicionados y\/o definidos permitir\u00e1n evaluar mediante la aparici\u00f3n de fluorescencia y expresi\u00f3n de otros indicadores (pcr), posibles precursores de c\u00e9lulas pancre\u00e1ticas productoras de hormonas pancre\u00e1ticas. Estas c\u00e9lulas pueden ser aisladas mediante citometria de flujo estudiadas y cultivadas. La posible secreci\u00f3n regulada de insulina en estas c\u00e9lulas ser\u00e1 evaluada en todos los clones aislados.   3.-Tercer objetivo: identificaci\u00f3n de factores de diferenciaci\u00f3n.  se ha demostrado que las propias c\u00e9lulas embrionarias, cuando inician procesos de diferenciaci\u00f3n en los cuerpos embrionarios, inducen la diferenciaci\u00f3n de c\u00e9lulas vecinas, bien mediante interacci\u00f3n c\u00e9lula-c\u00e9lula o bien por la liberaci\u00f3n de factores a\u00fan por caracterizar. La presencia de indicadores fluorescentes del proceso de diferenciaci\u00f3n bien por eliminaci\u00f3n de fluorescencia (oct4-gfp: objetivo 1), como de aparici\u00f3n de fluorescencia en caso de linaje endod\u00e9rmico (afp-gfp: objetivo 2) nos permite la posible evaluaci\u00f3n de sustancias activas en los medios condicionados estudiando la evoluci\u00f3n de fluorescencia en cultivos seleccionados. Medios condicionados de cuerpos embrionarios ser\u00e1n concentrados mediante membranas selectivas y la fracci\u00f3n proteica resultante junto con los oportunos controles de medios sin condicionar ser\u00e1n fraccionadas mediante diferentes aproximaciones cromatogr\u00e1ficas (filtraci\u00f3n en gel, hplc). La actividad biol\u00f3gica de las fracciones resultantes ser\u00e1 evaluada en funci\u00f3n de la capacidad de inducir diferenciaci\u00f3n en c\u00e9lulas en monocapa transfectadas con oct4-gfp en funci\u00f3n de la disminuci\u00f3n de fluorescencia (evaluada por microscopia y citometria). Igualmente las fracciones ser\u00e1n ensayadas por incremento de fluorescencia en cuanto a su facultad de inducir diferenciaci\u00f3n hacia linaje endod\u00e9rmico con c\u00e9lulas transfectadas con los constructos afp-gfp o ins-gfp, que incluyen la expresi\u00f3n de la prote\u00edna verde bajo control de promotores caracter\u00edsticos del linaje endod\u00e9rmico como alfa-fetoproteina o insulina. Las fracciones positivas ser\u00e1n sometidas a purificaci\u00f3n ulterior y an\u00e1lisis mediante electroforesis bidimensional y espectroscopia de masas.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Valoraci\u00f3n de protocolos de diferenciaci\u00f3n in vitro de c\u00e9lulas madre embrionarias de rat\u00f3n hacia endodermo pancre\u00e1tico mediante el an\u00e1lisis de poblaciones celulares que expresan marcadores caracter\u00edsticos<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Valoraci\u00f3n de protocolos de diferenciaci\u00f3n in vitro de c\u00e9lulas madre embrionarias de rat\u00f3n hacia endodermo pancre\u00e1tico mediante el an\u00e1lisis de poblaciones celulares que expresan marcadores caracter\u00edsticos <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 N\u00e9stor Vicente Salar <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Miguel hern\u00e1ndez de elche<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 23\/07\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Juan  Antonio Reig Maci\u00e1<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Carlos Sim\u00f3n vall\u00e9s <\/li>\n<li>joaqu\u00edn Rueda puente (vocal)<\/li>\n<li>amelia Aranega jimenez (vocal)<\/li>\n<li>Jos\u00e9 Mar\u00eda P\u00e9rez pomares (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de N\u00e9stor Vicente Salar Transgenes, diferenciaci\u00f3n y selecci\u00f3n celular. los procesos de diferenciaci\u00f3n espont\u00e1neos en monocapa o en 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