{"id":95910,"date":"2018-03-11T10:15:59","date_gmt":"2018-03-11T10:15:59","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/hiperoxaluria-primaria-tipo-i-enfermedad-conformacional\/"},"modified":"2018-03-11T10:15:59","modified_gmt":"2018-03-11T10:15:59","slug":"hiperoxaluria-primaria-tipo-i-enfermedad-conformacional","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/la-laguna\/hiperoxaluria-primaria-tipo-i-enfermedad-conformacional\/","title":{"rendered":"Hiperoxaluria primaria tipo i: enfermedad conformacional"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Cristina Yunta Yanes <\/strong><\/h2>\n<p>La hiperoxaluria es una enfermedad que se define como el aumento de concentraci\u00f3n de oxalato en los fluidos biol\u00f3gicos (osswald et al., 1979). Los dep\u00f3sitos de oxalato se manifiestan como urolitiasis, nefrocalcinosis, pielonefritis y en casos extremos como fallo renal seguido de una oxalosis sist\u00e9mica. La enfermedad se clasifica en hiperoxaluria primaria, de origen gen\u00e9tico, e hiperoxaluria secundaria, con origen ambiental. La hiperoxaluria primaria tipo i (hop1) es una enfermedad de origen gen\u00e9tico y hereditario con herencia autos\u00f3mica recesiva con marcado car\u00e1cter monog\u00e9nico. Est\u00e1 causada por la deficiencia de la enzima alanina:glioxilato aminotransferasa (agt) que es una prote\u00edna peroxisomal hep\u00e1tica cuyo cofactor es el piridoxal fosfato (plp). Su funci\u00f3n principal que es la detoxificaci\u00f3n del glioxilato (takada, 1984); cataliza la transaminaci\u00f3n irreversible del glioxilato a glicina (danpure, 2001; barrat, 1999; danpure, 1996). En pacientes de hop1, la agt es incapaz de convertir el glioxilato en glicina, este se acumula y sumado al producido por la dao (d-amino\u00e1cido oxidasa) y la go (glicolato oxidasa) se oxida hasta convertirse en oxalato.  se han encontrado muchas mutaciones responsables de causar la enfermedad. En general, para que tengan efecto, la mayor\u00eda de las mutaciones cosegregan con el alelo minor. Sin embargo, se han descubierto nuevas mutaciones que causan la enfermedad con independencia del haplotipo.  Se define como haplotipo minor a los siguientes cambios: (i)ex\u00f3n1-c154t provocando el cambio pro11leu, (ii)ex\u00f3n 2-c386t originando un cambio sin\u00f3nimo, (iii)ex\u00f3n 10- a1142g conducente al cambio ile340met se conocen haplotipos recombinantes), (iv) duplicaci\u00f3n de 74 pb en el intr\u00f3n 1 y la aparici\u00f3n de un vntr del virus epstein-barr en el cuarto intr\u00f3n.  el objetivo general del presente trabajo pivota en torno a la hip\u00f3tesis que la mayor\u00eda de los casos de hop1, debidos a mutaciones del gen agxt, son ejemplos de enfermedad conformacional. En este grupo de enfermedades, cambios en la secuencia de amino\u00e1cidos consecuencia podr\u00edan conllevar modificaciones en la estructura tridimensional de la prote\u00edna jugando un papel central en el desarrollo de la enfermedad. El conocimiento del efecto de estos cambios sentar\u00e1 la base de posibles estrategias terap\u00e9uticas, mutaci\u00f3n-espec\u00edficas, basadas en el uso de mol\u00e9culas capaces de modificar el plegamiento proteico.   para avanzar en esta hip\u00f3tesis, nos planteamos los siguientes objetivos concretos:  a. Optimizaci\u00f3n de la expresi\u00f3n de agt en e.Coli. Una parte central en la caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica de prote\u00ednas es el perfeccionamiento de los m\u00e9todos de expresi\u00f3n, probando diferentes promotores, condiciones de inducci\u00f3n, solubilizaci\u00f3n, y purificaci\u00f3n de la prote\u00edna recombinante. Especialmente, probaremos la hip\u00f3tesis que la coexpresi\u00f3n de chaperones moleculares y la prote\u00edna agt puede mejorar el rendimiento de los m\u00e9todos de expresi\u00f3n.   b. Definici\u00f3n de residuos importantes en los trastornos conformacionales en la prote\u00edna agt. Utilizando como modelo la combinaci\u00f3n polimorfismo-mutaci\u00f3n m\u00e1s importante en nuestro medio (p11l + i244t), planteamos un rastreo de residuos relevantes en su d\u00e9ficit funcional mediante mutag\u00e9nesis aleatoria y recuperaci\u00f3n en un organismo modelo sencillo: e.Coli. Este escrutinio es dependiente del desarrollo de un sistema de selecci\u00f3n por auxotrof\u00eda, que ser\u00e1 un objetivo concreto de esta tesis doctoral.   c. Caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica de la prote\u00edna agt, variantes mutadas relevantes y mutaciones nuevas diagnosticadas en nuestro laboratorio. Idealmente, llevaremos la caracterizaci\u00f3n estructural de las variantes mutadas hasta la cristalizaci\u00f3n si es posible. Si no se lograran obtener cristales, concluiremos con la caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica de agt en soluci\u00f3n.  d. Caracterizaci\u00f3n estructural de la prote\u00edna go. La cristalizaci\u00f3n de prote\u00ednas y su an\u00e1lisis por difracci\u00f3n de rayos x son elementos cruciales en el estudio de las consecuencias f\u00edsico-qu\u00edmicas de las mutaciones y en la b\u00fasqueda de estrategias que mejoren el plegamiento funcional de las prote\u00ednas mutadas. Para aprender la metodolog\u00eda necesaria nos planteamos expresar y cristalizar la glicolato oxidasa de rat\u00f3n. La elecci\u00f3n de esta prote\u00edna se basa en que es una diana terap\u00e9utica potencial en la que queremos probar la acci\u00f3n de inhibidores de la producci\u00f3n de oxalato.  el trabajo desarrollado abord\u00f3 el estudio de la hop1 desde muy diversos puntos de vista los resultados son una muestra heterog\u00e9nea, aunque no dispar en lo que t\u00e9cnicas y modos de abordar el problema se refiere. Los resultados y las conclusiones que se deducen de ellos se pueden resumir como sigue:  1. La experimentaci\u00f3n con sistemas de expresi\u00f3n proteica en bacterias nos condujo al uso de un sistema de inducci\u00f3n en fr\u00edo (pcoldii). Con \u00e9l, la producci\u00f3n de agt*ltm, responsable de hop1 predominante en canarias, aument\u00f3 pero mayoritariamente como prote\u00edna insoluble.   2. La solubilidad de las formas mutantes de agt que conducen a la agregaci\u00f3n, total o parcial, de la misma se ve mejora cuando estas son expresadas en presencia de del complejo groe. Sin embargo, cuando es expresada en presencia de dnaj\/dnak\/grpe o tf no se aprecia dicho efecto. El incremento de la solubilidad de la variante mutada se traduce en un aumento de la actividad agt en extractos celulares. Esta relaci\u00f3n actividad\/solubilidad es v\u00e1lida para aquellas formas en que la mutaci\u00f3n conlleva agregaci\u00f3n proteica.  3. Los ensayos realizados con chaperones qu\u00edmicos que hab\u00edan mostrado previamente mejoras en la solubilidad de agt*ltm expresada en c\u00e9lulas de mam\u00edfero, confirmaron que el compuesto quinacrina aumenta la solubilidad de la prote\u00edna mutante expresada en e.Coli.   4. La caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica de las formas no patol\u00f3gicas de agt concluyen en la ausencia de diferencias entre ellas en cuanto a su comportamiento hidrodin\u00e1mico y estructura secundaria se refiere. Sin embargo, existen diferencias frente a la prote\u00edna silvestre y agt*r que guardan relaci\u00f3n con las propiedades espectrosc\u00f3picas en el uv cercano y el visible conferidas por la uni\u00f3n del plp. En cuanto a la estabilidad t\u00e9rmica de estas formas la mayor\u00eda de los cambios respecto a agt*wt, salvo i340m, suponen una desestabilizaci\u00f3n. Agt*lm muestra claramente una estabilidad menor, de la que el polimorfismo p11l es el \u00fanico responsable. Al igual sucede con agt*t y agt*r aunque en menor grado. Es predecible que agt*ltm y agt*lrm sean mucho m\u00e1s inestables, como resultado de la sinergia de los cambios.   5. El an\u00e1lisis funcional de nuevas mutaciones halladas por nuestro grupo en pacientes de hop1 ha dado informaci\u00f3n respecto a alguno de esos cambios. El cambio s218l es responsable directo de la reducci\u00f3n de la actividad con independencia de su efecto en la solubilidad. Los cambios r197q y r381k parecen no tener grandes efectos en la solubilidad de agt. Adem\u00e1s, el cambio r381k no muestra grandes diferencias frente a agt*wt cuando analizamos su actividad en la fracci\u00f3n soluble de un extracto crudo y la actividad de agt*lkm es similar a la mostrada por agt*lm. En contraposici\u00f3n, la forma agt*l197qm muestra valores inferiores a los presentados por agt*lm aunque similares a los de la forma agt*l no considerada patol\u00f3gica. La aparici\u00f3n de ambos cambios en cis, hace sospechar que quiz\u00e1s act\u00faen de manera sin\u00e9rgica. La sustituci\u00f3n d210e provoca modificaciones similares a las originadas por el cambio g170r. En ambos casos cuando la mutaci\u00f3n est\u00e1 presente en el haplotipo major la prote\u00edna es correctamente importada al peroxisoma mientras que cuando la mutaci\u00f3n se presenta en el haplotipo minor es importada a la mitocondria. Finalmente, la mutaci\u00f3n h83r no provoca la agregaci\u00f3n mayoritaria de agt al ser expresada en e.Coli, independientemente del haplotipo en el que se encuentre. Sin embargo, es la responsable absoluta de la ausencia de actividad espec\u00edfica. La caracterizaci\u00f3n f\u00edsico-qu\u00edmica de agt*83r y agt*l83rm confirma grandes diferencias con respecto a agt*wt y agt*lm en las propiedades espectrosc\u00f3picas que confiere la uni\u00f3n del plp.   6. La glicolato oxidasa de rat\u00f3n (mgo) consiste en un tetr\u00e1mero cuyos mon\u00f3meros se relacionan mediante un eje de simetr\u00eda cuaternario y presentan la estructura de barril \u00c2\u00bf\/\u00edY caracter\u00edstica. Posee una especie de tapa constituida por 31 amino\u00e1cidos (desde l177 hasta v209), que se corresponde con la zona de mayor movilidad de la enzima. La comparaci\u00f3n de las diferentes estructuras resueltas (mgo_glioxilato: loop cerrado y mgo_e7: loop abierto) permite postular el mecanismo de apertura y cierre de dicha tapa. En el centro activo el trp110 se sit\u00faa entre el glioxilato y el loop actuando como la tapa que a\u00edsla la reacci\u00f3n del medio, las restricciones geom\u00e9tricas del trp110 y el impedimento est\u00e9rico observados al comparar la estructura abierta y la estructura cerrada indican que el cambio de conformaci\u00f3n del trp110 implica necesariamente la apertura de la tapa. El conocimiento de la estructura de la glicolato oxidasa de rat\u00f3n, de su centro activo y el mecanismo de apertura y cierre del loop de acceso a dicho centro activo es un primer paso en la b\u00fasqueda de compuestos que pudieran inhibirla sin causar efectos no deseados sobre otras enzimas similares.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Hiperoxaluria primaria tipo i: enfermedad conformacional<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Hiperoxaluria primaria tipo i: enfermedad conformacional <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Cristina Yunta Yanes <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 La laguna<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 15\/09\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Eduardo Salido Ruiz<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: armando Torres ramirez <\/li>\n<li>alfredo Santana rodr\u00edguez (vocal)<\/li>\n<li>Jos\u00e9 Antonio Gomez vidal (vocal)<\/li>\n<li>v\u00edctor Lorenzo sellares (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Cristina Yunta Yanes La hiperoxaluria es una enfermedad que se define como el aumento de concentraci\u00f3n de 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