{"id":96071,"date":"2018-03-11T10:16:13","date_gmt":"2018-03-11T10:16:13","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/cultivo-in-vitro-de-esponjas-marinas-experiencias-con-crambe-crambe-y-axinella-damicornis\/"},"modified":"2018-03-11T10:16:13","modified_gmt":"2018-03-11T10:16:13","slug":"cultivo-in-vitro-de-esponjas-marinas-experiencias-con-crambe-crambe-y-axinella-damicornis","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/ingenieria-y-tecnologia-quimicas\/cultivo-in-vitro-de-esponjas-marinas-experiencias-con-crambe-crambe-y-axinella-damicornis\/","title":{"rendered":"Cultivo in vitro de esponjas marinas. experiencias con crambe crambe y axinella damicornis"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Tarik Chileh <\/strong><\/h2>\n<p>Las esponjas marinas representan una fuente potencial de muchos metabolitos \u00fanicos, incluyendo compuestos anticancer\u00edgenos. Varios compuestos bioactivos con actividades substanciales citot\u00f3xicas y antivirales han sido aislados de estas especies (blunt et al., 2009). Sin embargo, el conocimiento de los requisitos nutritivos de esponjas marinas para mantener un cultivo in vitro eficiente y sostenido es insuficiente y no muy preciso. En el filo de invertebrados marinos, excepto porifera, se han hecho muchos intentos usando un medio comercial t\u00edpico que se usa en el cultivo de c\u00e9lulas animales (especialmente insectos y c\u00e9lulas mam\u00edferas) basado en fuentes de cod. Los medios de cultivos usados incluyen dmem, rpmi, m199, l-15, etc. (Muldford et al., 2000). Una de las razones para este fracaso es el uso de promotores de crecimiento dif\u00edcilmente identificables, basados en sueros de animales terrestres. Una alternativa para estos suplementos de origen terrestre es el uso de extractos isog\u00e9nicos y alog\u00e9nicos y\/o sueros de animales marinos, que pueden contener nutrientes necesarios para el crecimiento.  la biomasa de esponjas para la producci\u00f3n de los compuestos bioactivos es generalmente obtenida a partir de explantes cultivados en el mar y acuarios. Las esponjas cultivadas por estos m\u00e9todos pueden estar, en la mayor\u00eda de los casos, contaminadas por varias poblaciones microbianas. En vista de \u00e9sto, el inter\u00e9s se centra en la posibilidad de utilizar cultivos puros de c\u00e9lulas de esponja en suspensi\u00f3n, y en agregados celulares (primorfos) para la producci\u00f3n de los compuestos de inter\u00e9s. Se han establecido protocolos para obtenci\u00f3n de suspensiones celulares primarias a partir del tejido de esponja (m\u00ed\u00bcller et al., 1999), sin embargo no se ha obtenido ninguna l\u00ednea inmortal de c\u00e9lulas (belarbi et al., 2003a).  las c\u00e9lulas cultivadas en suspensi\u00f3n son expuestas a fuerzas de corte hidrodin\u00e1micas y mec\u00e1nicas que no se dan en la matriz de la esponja. Igual que en la mayor\u00eda de los tipos de c\u00e9lulas animales (chisti, 2000, 2001), las c\u00e9lulas de esponja libremente suspendidas son susceptibles de ser da\u00f1adas por estas fuerzas, pero no se dispone de ning\u00fan dato sobre tales efectos.   un problema esencial que dificulta el trabajo de qui\u00e9n se dedica a investigar con esponjas marinas es la disponibilidad del material biol\u00f3gico. Muchas veces resulta inviable la recolecci\u00f3n del material biol\u00f3gico, bien por restricciones medioambientales o por problemas t\u00e9cnicas (el centro de experimentaci\u00f3n se encuentra alejado del mar, malas condiciones clim\u00e1ticas, etc.). La criopreservaci\u00f3n de trozos de esponjas marinas podr\u00eda ser una buena soluci\u00f3n para resolver este obst\u00e1culo. Esta t\u00e9cnica, tambi\u00e9n es de gran inter\u00e9s para facilitar el estudio de diversos procesos metab\u00f3licos que var\u00edan estacionalmente.   para abordar algunos de los problemas expresadas en p\u00e1rrafos anteriores se planificaron una serie de experimentos cuyos resultados y conclusiones se describen resumidamente a continuaci\u00f3n.  cultivo de explantes de la esponja marina crambe crambe en sistemas abiertos y cerrados.  los explantes de la esponja marina crambe crambe fueron cultivados en agua marina natural y filtrada (fnfsw), con y sin adici\u00f3n de la microalga marina phaeodactylum tricornutum en un sistema de flujo continuo y discontinuo (cfths y dfths, respectivamente). El control del crecimiento de los explantes se ha realizado midiendo su peso bajo el agua. En el experimento llevado a cabo en un sistema de flujo continuo (cfths), el peso bajo el agua de los explantes aument\u00f3 hasta un promedio de 1380% comparado con el peso inicial en un intervalo de tiempo comprendido entre 22 y 45 d\u00edas dependiendo del explante. El crecimiento de los explantes cultivados en un sistema de flujo discontinuo (dfths), el peso bajo el agua de los explantes aument\u00f3 hasta un valor promedio del 322% respecto al peso inicial en un tiempo que oscil\u00f3 entre 102 a 210 d\u00edas. Adem\u00e1s, los explantes cultivados en dfths usando fnfsw con la adici\u00f3n de una suspensi\u00f3n de la diatomea phaeodactylum tricornutum, el crecimiento, en peso, fue de un promedio del 2% por d\u00eda. La cin\u00e9tica de crecimiento vari\u00f3 considerablemente para diferentes explantes. En los subcultivos realizados, los explantes crecieron m\u00e1s r\u00e1pido en los primeros 10 d\u00edas. Las elevadas velocidades de crecimiento observadas de explantes cultivadas en un sistema de flujo continuo (cfths) sugieren que la t\u00e9cnica del subcultivo es un m\u00e9todo prometedor para cultivar la esponja marina crambe crambe en sistemas abiertos.  cultivo de explantes de crambe crambe en medios con nutrientes org\u00e1nicos disueltos.  en primer lugar, se desarroll\u00f3 una nueva metodolog\u00eda para demostrar el consumo de carb\u00f3n org\u00e1nico disuelto (cod) por los explantes. As\u00ed, los experimentos fueron efectuados con explantes de la misma esponja adulta y el agua de mar artificial fue suplementado con diferentes concentraciones de fructosa para proporcionar concentraciones equivalentes de cod de 300, 400, 700 y 1200 mg l-1. El consumo fue evidente en las cuatro concentraciones ensayadas y fue m\u00e1s pronunciado durante las primeras 6 horas. Los datos de la asimilaci\u00f3n del cod fueron ajustados al modelo emp\u00edrico publicado por ferguson (1980), usado extensamente para la cin\u00e9tica de consumo de compuestos org\u00e1nicos disueltos en invertebrados marinos.   en segundo lugar, se estableci\u00f3 un protocolo para cultivar explantes in vitro. Se ensayaron diferentes medios a partir de un medio comercial rpmi 1640 enriquecido con sales inorg\u00e1nicas t\u00edpicas para generar agua de mar artificial y amino\u00e1cidos. Paralelamente se patent\u00f3 un procedimiento para obtener un extracto de pulpo y utilizarlo como suplemento en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos revelan que el uso del extracto de pulpo conjuntamente con el medio base enriquecido favorece notablemente el crecimiento de los explantes comparados con las formulaciones sin extracto, siendo, adem\u00e1s, la sobrevivencia de los explantes claramente m\u00e1s alta. Esta mejora del crecimiento produjo una alta actividad metab\u00f3lica en los explantes, como confirma el alto contenido del amonio y lactato en el medio despu\u00e9s de unos d\u00edas antes de su renovaci\u00f3n y el consumo elevado de glucosa. La acumulaci\u00f3n del lactato aument\u00f3 con el tama\u00f1o y la edad de los explantes. Previamente, se desarroll\u00f3 un m\u00e9todo alternativo y r\u00e1pido, basado en el tratamiento de imagen digital, para la determinaci\u00f3n precisa del volumen aparente del explante como medida de crecimiento.   modelo bioreacci\u00f3n-difusi\u00f3n para el crecimiento de explantes de esponja marina en biorreactores.  utilizando los datos de crecimiento obtenidos del cultivo in vitro de explantes en medios con nutrientes org\u00e1nicos disueltos, se desarroll\u00f3 un modelo de crecimiento basado en el control del transporte por difusi\u00f3n de los nutrientes del medio circundante, a trav\u00e9s de un sistema acu\u00edfero deficientemente desarrollado. Se asume que el crecimiento obedece a una cin\u00e9tica tipo monod. El modelo explica satisfactoriamente el comportamiento de crecimiento de la esponja marina crambe crambe medido en dos medios diferentes. Adem\u00e1s, el modelo es consistente con datos publicados para el crecimiento de explantes de las esponjas disidea avara y hemimycale columella. Seg\u00fan el modelo y las observaciones experimentales, la velocidad de crecimiento instant\u00e1neo depende del tama\u00f1o del explante y de todos los factores de los que depende la difusi\u00f3n de nutrientes cr\u00edticos al explante.  estr\u00e9s mec\u00e1nico e hidrodin\u00e1mico en suspensiones de c\u00e9lulas de esponja.  en este trabajo se demuestra c\u00f3mo la viabilidad celular est\u00e1 afectada negativamente por las etapas del protocolo de m\u00ed\u00bcller (1999) relacionadas con la turbulencia, siendo \u00e9sta un factor crucial a tener en cuenta en la optimizaci\u00f3n de los protocolos de disociaci\u00f3n y reagregaci\u00f3n celular dirigidos a cultivos de c\u00e9lulas de esponjas marinas en biorreactores.   los explantes de axinella damicornis fueron disgregados seg\u00fan el protocolo de m\u00ed\u00bcller (1999) y suplementando el agua de mar artificial libre de calcio y magnesio (cmfsw) con y sin el aditivo protector pluronic f-68 (0.1% wt\/v). El da\u00f1o celular se redujo notablemente y se mejor\u00f3 el rendimiento de la recuperaci\u00f3n de las c\u00e9lulas viables en las cuatro etapas del protocolo de m\u00ed\u00bcller. La agitaci\u00f3n orbital a 75 rpm condujo pr\u00e1cticamente a la muerte de todas las c\u00e9lulas en menos de 2.5 horas, por el contrario la fracci\u00f3n viable y los niveles de debris celular permanecieron estables durante 6 h de agitaci\u00f3n a 100 rpm en suspensiones suplementadas con pf-68. A 3\u00c2\u00bac la viabilidad celular se mantiene durante m\u00e1s tiempo que a 17\u00c2\u00bac. Mediante un modelo de cuatro etapas se describe la cin\u00e9tica de la muerte y de la fragmentaci\u00f3n celular con un error del \u00c2\u00b1 10%.  ensayos de bioactividad de la esponja marina crambe crambe.  estos experimentos se refieren al crecimiento de los explantes de crambe crambe en t-flasks, efectuados en una c\u00e1mara termost\u00e1tica [ciclos luz_oscuridad (12h\/12h) sin co2] y en un incubador en oscuridad y con co2, con el fin de analizar las crambescidinas existentes en los explantes. La cuantificaci\u00f3n de las crambescidinas en la biomasa liofilizada fue realizada por la empresa pharmamar. Los resultados obtenidos mostraron que una gran parte de los explantes perdieron sus capacidades citost\u00e1ticas y citot\u00f3xicas despu\u00e9s de unos d\u00edas de cultivo. Est\u00e1 perdida importante de bioactividad de los explantes pudo ser debida a la modificaci\u00f3n de factores que pueden afectar la composici\u00f3n de las sustancias bioactivos en esponjas marinas dentro de su h\u00e1bitat natural.   criopreservaci\u00f3n y subcultivo de explantes.  este estudio se ha centrado principalmente en la utilizaci\u00f3n de distintos medios de cultivo para la criopreservaci\u00f3n de explantes y suspensiones celulares de la esponja marina crambe crambe. La evaluaci\u00f3n del efecto de la criopreservaci\u00f3n se realiz\u00f3 a trav\u00e9s del an\u00e1lisis de viabilidad celular por citometr\u00eda de flujo y realizando subcultivos de explantes criopreservados. Los resultados obtenidos mostraron que para los tres periodos de criopreservaci\u00f3n los medios rpmi+sw+e+ex con dmso (10%) protegieron mejor a los explantes. Los explantes de la esponja marina crambe crambe cultivados tras criopreservarlos experimentaron un crecimiento notable incluso conservaron la capacidad de adherirse entre ellos. Adem\u00e1s, el principal inconveniente para el cultivo posterior a la criopreservaci\u00f3n es f\u00e1cil tenderse a la contaminaci\u00f3n microbiol\u00f3gica, principalmente las producidas por hongos.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Cultivo in vitro de esponjas marinas. experiencias con crambe crambe y axinella damicornis<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Cultivo in vitro de esponjas marinas. experiencias con crambe crambe y axinella damicornis <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Tarik Chileh <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Almer\u00eda<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 21\/09\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Francisco Garc\u00eda Camacho<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: Fernando Camacho rubio <\/li>\n<li>alfonso Robles medina (vocal)<\/li>\n<li>Fernando De la calle verd\u00fa (vocal)<\/li>\n<li>sebasti\u00e1n S\u00e1nchez villasclaras (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Tarik Chileh Las esponjas marinas representan una fuente potencial de muchos metabolitos \u00fanicos, incluyendo compuestos anticancer\u00edgenos. 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