{"id":96770,"date":"2018-03-11T10:17:08","date_gmt":"2018-03-11T10:17:08","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/aplicacion-de-la-inmunohistoqua%c2%admica-al-diagnostico-de-vitalidad-en-las-heridas-cutaneas-incisas\/"},"modified":"2018-03-11T10:17:08","modified_gmt":"2018-03-11T10:17:08","slug":"aplicacion-de-la-inmunohistoqua%c2%admica-al-diagnostico-de-vitalidad-en-las-heridas-cutaneas-incisas","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/histopatologia\/aplicacion-de-la-inmunohistoqua%c2%admica-al-diagnostico-de-vitalidad-en-las-heridas-cutaneas-incisas\/","title":{"rendered":"Aplicaci\u00f3n de la inmunohistoqu\u00edmica al diagn\u00f3stico de vitalidad en las heridas cut\u00e1neas incisas"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Jos\u00e9 Antonio Ortiz Rey <\/strong><\/h2>\n<p>Justificaci\u00f3n y objetivos el diagn\u00f3stico de vitalidad de las heridas cut\u00e1neas es un problema que se plantea con frecuencia en patolog\u00eda forense. El diagn\u00f3stico diferencial entre heridas vitales y post m\u00f3rtem se basa generalmente en el estudio macrosc\u00f3pico complementado con la histolog\u00eda convencional y resulta menos dif\u00edcil cuando las heridas vitales tienen un tiempo largo de evoluci\u00f3n o ante lesiones post m\u00f3rtem producidas mucho despu\u00e9s del fallecimiento. En la pr\u00e1ctica, sin embargo, el pat\u00f3logo forense se ha de enfrentar a heridas ocurridas muy pr\u00f3ximas al momento de la muerte y puede ser necesario el uso de t\u00e9cnicas complementarias que se han ido desarrollando. entre ellas est\u00e1n la microscop\u00eda electr\u00f3nica, la histoqu\u00edmica enzim\u00e1tica, diferentes m\u00e9todos bioqu\u00edmicos, la inmunohistoqu\u00edmica (ihq) y, m\u00e1s recientemente, la biolog\u00eda molecular. Muchas de estas t\u00e9cnicas presentan, sin embargo, inconvenientes y como m\u00e9todo de estudio de la reacci\u00f3n vital y la data de las heridas, la ihq ofrece ventajas que la han convertido en el m\u00e9todo de elecci\u00f3n en las investigaciones actuales sobre esta materia (grellner y madea 2007). En el presente trabajo doctoral nos hemos propuesto como objetivo analizar en heridas cut\u00e1neas incisas mediante ihq la expresi\u00f3n de fibronectina (fn) y tenascina (tn), apoptosis, caspasa-3 y bcl-2, ciclooxigenasa-2 (cox-2), cadherina e, cateninas \u00c2\u00bf, \u00edY y \u00c2\u00bf y selectina p, as\u00ed como analizar la influencia de los artefactos de autolisis \/ putrefacci\u00f3n en los resultados de ihq. resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 2 introducci\u00f3n 1.- El problema de la reacci\u00f3n vital. la aparici\u00f3n de lesiones post m\u00f3rtem puede ser accidental (durante la manipulaci\u00f3n del cad\u00e1ver en el levantamiento, el transporte o la autopsia, o producida por animales) o intencionada: de origen yatrog\u00e9nico, o heridas dolosas con el fin de ocultar o sugerir un crimen, un accidente o un suicidio, o para impedir la identificaci\u00f3n de un cuerpo (hern\u00e1ndez-cueto 2004). el diagn\u00f3stico de vitalidad constituye uno de los objetivos principales del an\u00e1lisis medicolegal de las heridas cut\u00e1neas y resulta menos dif\u00edcil en lesiones evolucionadas, cuando el individuo sobrevivi\u00f3 cierto tiempo tras la agresi\u00f3n. Los mayores problemas aparecen en las heridas que han ocurrido muy pr\u00f3ximas al momento de la muerte, especialmente durante la agon\u00eda terminal o en el denominado periodo supravital inicial. Ser\u00e1 funci\u00f3n del pat\u00f3logo forense detectar reacci\u00f3n vital de muy poco tiempo de evoluci\u00f3n, e intentar diferenciarla de reacciones ag\u00f3nicas y supravitales y de cambios post m\u00f3rtem (oehmichen 2004). 2.- M\u00e9todos de investigaci\u00f3n de vitalidad en heridas cut\u00e1neas. la respuesta vital que se produce en una herida cut\u00e1nea consiste en la reacci\u00f3n inflamatoria y reparaci\u00f3n tisular subsiguiente, y los m\u00e9todos de investigaci\u00f3n de vitalidad tienen como objetivo detectar si se han producido estos procesos. en el \u00faltimo medio siglo se han ido desarrollando diferentes metodolog\u00edas para intentar ayudar al diagn\u00f3stico, como han sido t\u00e9cnicas de histoqu\u00edmica, bioqu\u00edmica y microscop\u00eda electr\u00f3nica (hern\u00e1ndez-cueto y cols. 2000). Los avances en la resoluci\u00f3n del problema se han producido paralelamente a la evoluci\u00f3n en el conocimiento de los mecanismos \u00edntimos de la curaci\u00f3n de la herida. 3.- La ihq en el estudio de la reacci\u00f3n vital. la reacci\u00f3n inflamatoria y curaci\u00f3n de la herida cut\u00e1nea implica complejas interacciones entre muchos tipos de c\u00e9lulas, con la intervenci\u00f3n de diversas sustancias mediadoras de la inflamaci\u00f3n y de componentes de la matriz extracelular (mec), y todos estos elementos han sido objeto de estudio en diferentes trabajos. Los marcadores que han recibido m\u00e1s atenci\u00f3n en la literatura o que presentan potencial inter\u00e9s se pueden clasificar en los siguientes grupos: resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 3 1- mol\u00e9culas proinflamatorias: entre ellas, se han investigado las citoquinas (sobre todo las interleuquinas 1, 6 y 10) y quemoquinas (grellner 2002; kondo y ohshima 1996) 2- mol\u00e9culas de adhesi\u00f3n: se han postulado como muy \u00fatiles las selectinas (dressler y cols. 1998). 3-prote\u00ednas de la mec: destaca la fn como marcador temprano de vitalidad y los diferentes tipos de col\u00e1geno, \u00fatiles para establecer la data de la herida. (Betz y cols. 1992; betz 1996). 4- c\u00e9lulas de la inflamaci\u00f3n y reparaci\u00f3n. 5- factores relacionados con crecimiento y muerte celular: se ha estudiado tanto la actividad proliferativa (por ejemplo determinando ki67) como la muerte celular (nivel de apoptosis) (betz y cols. 1997). 6- citoesqueleto y prote\u00ednas intracelulares musculares. material, m\u00e9todos y resultados a continuaci\u00f3n se resumen los materiales y m\u00e9todos empleados y los resultados obtenidos que se refieren en los siete art\u00edculos publicados que integran esta tesis. 1: detecci\u00f3n ihq de fibronectina y tenascina en heridas incisas de piel humana. estudiamos la expresi\u00f3n de fn y tenascina (tn) en 58 heridas cut\u00e1neas humanas (48 vitales y 10 post m\u00f3rtem). La edad de las heridas vitales variaba de 3 minutos a 8 horas y las muestras post m\u00f3rtem fueron recogidas despu\u00e9s de un intervalo tras la incisi\u00f3n de 15-180 minutos. Ciento treinta y siete secciones de tejido fijado en formol e inclu\u00eddo en parafina (media: 2.3 secciones por caso) se ti\u00f1eron con cada uno de los anticuerpos frente a fn y tn usando la t\u00e9cnica streptabc (complejo estreptavidina biotina). se observ\u00f3 una tinci\u00f3n reticular para fn en el borde de la herida y en la dermis en el 50% de las muestras vitales frente al 0% de los casos post m\u00f3rtem. La inmunorreactividad se redujo en 10 casos autolizados. En el 39.4% de las heridas vitales y el 60 % de los casos post m\u00f3rtem se observ\u00f3 positividad para fn exclusivamente en el margen de la herida. La tn fue negativa en todas las muestras. las \u00e1reas de hemorragia vitales y post m\u00f3rtem presentaron positividad para fn y tn. resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 4 2: expresi\u00f3n de fibronectina y tenascina como demostraci\u00f3n de reacci\u00f3n vital en la piel y el m\u00fasculo de rata. analizamos la expresi\u00f3n de fn y tn en heridas infligidas a 12 ratas adultas en la piel del abdomen. Se practic\u00f3 una herida incisa a los 5, 10 o 15 minutos antes de la muerte y otra a los 5 minutos despu\u00e9s de ser sacrificadas, la cual se recogi\u00f3 a los 45 minutos. Se ti\u00f1eron mediante ihq secciones fijadas en formol e inclu\u00eddas en parafina de un total de 36 muestras (media: 1.5 por herida) siguiendo la t\u00e9cnica streptabc. el estudio microsc\u00f3pico revel\u00f3 una tinci\u00f3n de patr\u00f3n reticular para fn en 18 de las 20 muestras vitales, y, para tn, en 16 sobre el total de 20, as\u00ed como en 2 de 16 muestras post m\u00f3rtem para fn y 3 de 16 post m\u00f3rtem para tn. Se observ\u00f3 tinci\u00f3n intracelular de fibras musculares en 7 de las 20 muestras vitales y en 5 del total de 16 post m\u00f3rtem. 3: demostraci\u00f3n de apoptosis en heridas de piel humana como un indicador de reacci\u00f3n vital. utilizamos una t\u00e9cnica de marcaje in situ (apop-tag\u00c2\u00ae) en 30 heridas quir\u00fargicas en piel humana con una edad de la herida que variaba desde 3 minutos a 8 horas. encontramos queratinocitos apopt\u00f3ticos en m\u00e1s del 50% de los casos con un intervalo posterior a la producci\u00f3n de la herida de al menos 120 minutos. No se observ\u00f3 apoptosis en heridas de menos de 120 minutos o en la piel normal, que se utiliz\u00f3 como control externo. 4: an\u00e1lisis de la expresi\u00f3n de caspasa-3 y prote\u00edna bcl-2 como posibles marcadores de vitalidad en heridas cut\u00e1neas. el estudio ha inclu\u00eddo 30 muestras procedentes de heridas incisas cut\u00e1neas humanas: 16 vitales obtenidas de incisiones quir\u00fargicas, con evoluci\u00f3n de 3 minutos a 8 horas, y 14 post m\u00f3rtem procedentes de incisiones abdominales de necropsia, que se recogieron al cabo de 1-3 horas de ser producidas. Se realiz\u00f3 t\u00e9cnica ihq sobre secciones fijadas en formol e inclu\u00eddas en parafina con el m\u00e9todo de estreptavidina marcada-biotina (lsab2\u00c2\u00ae, dakocytomation, dinamarca) y anticuerpos frente a caspasa-3 (cpp32) (policlonal, 1:100) y bcl-2 (clon 124, 1:20) (dakocytomation, dinamarca). no hubo inmunotinci\u00f3n para bcl-2 en los queratinocitos en ninguna de las heridas estudiadas. S\u00f3lo fueron positivas algunas c\u00e9lulas linfoides, que sirvieron como control interno de la t\u00e9cnica. Cpp32 fue tambi\u00e9n negativa en la epidermis y s\u00f3lo se observ\u00f3 tinci\u00f3n ocasional de capilares y fibroblastos. No se encontr\u00f3 sobreexpresi\u00f3n de resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 5 ambos marcadores al comparar el borde de la herida con el margen opuesto de la muestra ni las heridas vitales con las post m\u00f3rtem. 5: an\u00e1lisis de la expresi\u00f3n de ciclooxigenasa-2 como un posible marcador de vitalidad en heridas cut\u00e1neas. se estudiaron 41 muestras de heridas cut\u00e1neas incisas humanas, incluyendo: 16 heridas vitales con edad de 3 minutos a 8 horas (media: 125 minutos), 14 producidas post m\u00f3rtem (recogidas despu\u00e9s de un periodo de 1-3 horas), y 11 cicatrices de incisiones quir\u00fargicas suturadas cuyo tiempo de evoluci\u00f3n era de 0.5 a 11 meses. Se ti\u00f1eron mediante ihq secciones fijadas en formol e inclu\u00eddas en parafina con la t\u00e9cnica de estreptavidina marcada-biotina utilizando un anticuerpo monoclonal anti cox-2 (dakocytomation). todas las muestras mostraron inmunorreactividad normal para la cox-2 en las gl\u00e1ndulas ecrinas, con tinci\u00f3n d\u00e9bil de las gl\u00e1ndulas seb\u00e1ceas y la capa basal de la epidermis. No se observaron diferencias de tinci\u00f3n al comparar el borde de la herida con el margen opuesto de la muestra, ni entre las heridas vitales y las post m\u00f3rtem. Las cicatrices con reacci\u00f3n inflamatoria en la dermis (con edad igual a 0.5 a 3 meses) presentaron sobreexpresi\u00f3n de cox-2 en histiocitos y c\u00e9lulas mononucleares. 6: expresi\u00f3n de cadherina e y cateninas en heridas cut\u00e1neas vitales y post m\u00f3rtem. el estudio incluy\u00f3 42 heridas incisas humanas (32 vitales y 10 post m\u00f3rtem) y 3 cicatrices cut\u00e1neas. Las heridas vitales proced\u00edan de incisiones quir\u00fargicas abdominales con un intervalo tras la herida comprendido entre 55 minutos y 8 horas. Dos de las cicatrices ten\u00edan 2 meses y la otra 5 meses de evoluci\u00f3n. Las muestras post m\u00f3rtem se obtuvieron de incisiones abdominales aut\u00f3psicas y se recogieron despu\u00e9s de un periodo medio de 105 minutos (rango: 15-180). Se ti\u00f1eron mediante ihq secciones fijadas en formol e inclu\u00eddas en parafina, con la t\u00e9cnica de estreptavidina marcada-biotina y anticuerpos monoclonales frente a cadherina e (biogenex) y cateninas alfa, beta y gamma (transduction laboratories). Se evalu\u00f3 la tinci\u00f3n del borde de la herida compar\u00e1ndolo con el margen opuesto de la muestra. se constataron diferencias sutiles de tinci\u00f3n entre los dos bordes de la muestra en 11 casos (9 vitales y 2 post m\u00f3rtem). Hab\u00eda aumento de tinci\u00f3n en el borde correspondiente a la herida en 7 casos y en el margen control en 4. Las diferencias correspondieron a la cadherina e en 5 casos, la catenina alfa y la gamma en 3. No se apreciaron diferencias para la catenina beta. resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 6 7: an\u00e1lisis inmunohistoqu\u00edmico de la selectina p como posible marcador de vitalidad en heridas cut\u00e1neas humanas. cuarenta y cinco heridas cut\u00e1neas incisas (24 vitales, 14 post m\u00f3rtem, 7 en las que se indujo autolisis\/putrefacci\u00f3n) se ti\u00f1eron mediante ihq con anticuerpos frente a selectina p y cd31. Se calcul\u00f3 el porcentaje de luces te\u00f1idas con selectina p sobre el total de vasos positivos para cd31 (\u00edndice s-p\/cd31) en ambos bordes de cada muestra. en las muestras vitales el \u00edndice s-p\/cd31 oscil\u00f3 entre 10.7% y 71.4% en el borde de la herida, y entre el 12.5 y el 58.8 % en el margen opuesto, con un cociente entre ambos \u00edndices de 0.37-1.77 (media: 0.94). En los casos post m\u00f3rtem, el \u00edndice variaba desde el 22.5% al 69.2% en el borde de herida, y del 28 al 89.5% en el margen opuesto, con un cociente entre ambos \u00edndices de 0.76-1.9 (media: 0.96). Las diferencias entre los cocientes no fueron estad\u00edsticamente significativas, lo que imped\u00eda una valoraci\u00f3n de vitalidad. discusi\u00f3n 1.- Mol\u00e9culas de la mec: fn y tn. una de las mol\u00e9culas que ha recibido m\u00e1s atenci\u00f3n en los estudios de ihq aplicados a la patolog\u00eda forense ha sido la fn, que se ha propuesto como un buen marcador de reacci\u00f3n vital en diferentes tejidos. Betz y cols. Describieron como patr\u00f3n vital de expresi\u00f3n ihq de la fn, una tinci\u00f3n reticular en la dermis adyacente al borde de la herida y propusieron, por tanto, que es un marcador de vitalidad de gran sensibilidad, detectable en heridas de pocos minutos de evoluci\u00f3n (betz y cols. 1992). en nuestra serie, sin embargo, la sensibilidad de la t\u00e9cnica ha sido m\u00e1s baja y destaca la heterogeneidad de los resultados. s\u00f3lo encontramos tinci\u00f3n reticular en la mitad de las heridas vitales estudiadas (19 de 38 casos) y casi todas las restantes (15 casos) la presentaron en el borde de la herida, sin tinci\u00f3n en red, lo que resultaba inaceptable como positividad de la prueba. por otra parte cabe se\u00f1alar que los casos positivos ten\u00edan una edad m\u00ednima de 20 minutos y en las 4 heridas de s\u00f3lo 3-10 minutos no hubo tinci\u00f3n. adem\u00e1s, el di\u00e1metro m\u00e1ximo del \u00e1rea de tinci\u00f3n reticular fue muy variable (0.1 a 4.1 mm) y no todas las secciones de las heridas positivas presentaron este patr\u00f3n. en lo que se refiere a la tn, la tinci\u00f3n fue negativa en todos los casos vitales de edad comprendida entre 3 minutos y 8 horas, as\u00ed como en las heridas post m\u00f3rtem, por lo que el marcador no ha sido \u00fatil. Tn se sobreexpres\u00f3 en las cicatrices (de 20 a 82 d\u00edas de evoluci\u00f3n, media: 41.6). resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 7 hay que se\u00f1alar que las \u00e1reas de hemorragia han presentado positividad para fn y tn, tanto en heridas vitales como post m\u00f3rtem, con lo cual la prueba pierde valor. la comparaci\u00f3n entre heridas vitales y post m\u00f3rtem producidas en intervalos muy cortos antes o despu\u00e9s de la muerte con cronolog\u00eda bien controlada, s\u00f3lo es posible en heridas experimentales. Por ello hemos estudiado mediante ihq ambas mol\u00e9culas en una serie de heridas en piel de rata. aunque en la mayor\u00eda de las heridas vitales encontramos tinci\u00f3n reticular para los dos marcadores (90% para fn y 80% para tn) la reacci\u00f3n no fue completamente espec\u00edfica y se observ\u00f3 en algunas heridas post m\u00f3rtem (12.5% para fn y 18.7% para tn). Esta falta de especificidad ya se hab\u00eda comunicado previamente en alg\u00fan otro estudio (grellner y cols. 1998). la falta de especificidad es a\u00fan m\u00e1s destacable en el caso de la reactividad intracelular para fn del m\u00fasculo estriado esquel\u00e9tico, que est\u00e1 descrita como signo de vitalidad (fechner y cols. 1993), y nosotros constatamos con frecuencia muy similar tanto en heridas vitales como post m\u00f3rtem (35% frente a 31.25% respectivamente). por \u00faltimo hemos observado en la rata que el patr\u00f3n ihq de reacci\u00f3n para fn y tn fue diferente al de la piel humana tanto en la piel normal como en las heridas. Esto pone de manifiesto la necesidad de complementar las investigaciones en animales, que sirven como fuente de conocimiento b\u00e1sico del problema, con estudios sobre material humano. 2.- Apoptosis y prote\u00ednas relacionadas (caspasa-3 y bcl-2). 2.1.- Detecci\u00f3n de apoptosis. existen pocos trabajos publicados sobre la aplicaci\u00f3n del estudio de la apoptosis al an\u00e1lisis de la herida. Betz y cols. Consideran que la detecci\u00f3n de fibroblastos d\u00e9rmicos en apoptosis es \u00fatil para datar heridas cut\u00e1neas: la presencia de m\u00e1s de una c\u00e9lula positiva en un \u00e1rea de 0.01 x 0.01 cm indicar\u00eda una edad m\u00ednima de la herida de un d\u00eda y si hay m\u00e1s de 3 c\u00e9lulas, de al menos 19 d\u00edas (betz y cols. 1997). Estos autores no consideraron los resultados en la epidermis para eliminar el error que se producir\u00eda por la apoptosis fisiol\u00f3gica. En nuestro estudio, los resultados m\u00e1s significativos se produjeron, sin embargo, en la epidermis y los controles que inclu\u00edmos de piel normal fueron negativos con la t\u00e9cnica utilizada (m\u00e9todo tunel, kit apop-tag\u00c2\u00ae). Hemos observado positividad nuclear en los fibroblastos d\u00e9rmicos de 17 heridas sobre un total de 20 casos de 60-360 minutos de evoluci\u00f3n y, en menor grado, en adipocitos y c\u00e9lulas resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 8 endoteliales. El hallazgo de c\u00e9lulas positivas en la dermis puede ser, por tanto, un marcador de vitalidad, pero los resultados son m\u00e1s llamativos en la epidermis. detectamos apoptosis en los queratinocitos de los estratos profundos de la epidermis (basal y espinoso) en 8 de los 15 casos de 120-360 minutos de evoluci\u00f3n, que era m\u00e1s evidente en el borde correspondiente a la herida o, incluso, en toda la muestra. llaman la atenci\u00f3n las diferencias en la cronolog\u00eda de la positividad de la t\u00e9cnica al comparar nuestros resultados con otros trabajos que utilizaron el mismo m\u00e9todo (betz y cols. 1997; sawaguchi y cols. 2000). Esta discordancia se podr\u00eda poner en relaci\u00f3n con las diferencias en el tipo de material utilizado (muestras de autopsia frente a heridas quir\u00fargicas sin autolisis en nuestro caso), el retraso en la fijaci\u00f3n y, un factor importante, el tipo de lesiones estudiadas, que en la serie de sawaguchi y cols. correspond\u00edan a contusiones. 2.2.- Prote\u00ednas relacionadas con apoptosis: caspasa-3 y bcl-2. en nuestra serie, el an\u00e1lisis de ihq de bcl-2 y de caspasa-3 (cpp32) en 16 heridas vitales y 14 post m\u00f3rtem en piel humana no ha mostrado cambios en la expresi\u00f3n. Bcl-2 fue negativo en la epidermis de manera constante (\u00fanicamente se ti\u00f1eron ocasionales linfocitos de la dermis) y cpp-32 se expres\u00f3 en ocasionales fibroblastos y aislados vasos. No hubo diferencias de inmunotinci\u00f3n entre ambos bordes de las muestras ni entre las lesiones vitales y las post m\u00f3rtem, por lo que no sirven como marcadores de vitalidad. Ello puede estar en relaci\u00f3n con el poco tiempo de evoluci\u00f3n de nuestros casos, teniendo en cuenta los resultados de kane y greenhalgh, que comunican el aumento de bcl-2 en heridas de 12 horas en rat\u00f3n (kane y greenhalgh 2000). 3.- Mol\u00e9cula proinflamatoria: cox-2. no hay apenas estudios sobre la determinaci\u00f3n ihq de cox-2 en heridas cut\u00e1neas en general y los pocos que existen se realizaron en especies diferentes a la humana (futagami y cols. 2002). Algunos trabajos analizan mediante m\u00e9todo bioqu\u00edmico los niveles de cox-2 ante diferentes est\u00edmulos con discrepancias en los resultados: el comienzo de la inducci\u00f3n de cox-2 despu\u00e9s del est\u00edmulo se registra en un intervalo que va desde las 3 a las 12 horas ( he y cols. 2001; futagami y cols. 2002). en nuestro estudio, que incluy\u00f3 heridas vitales con un amplio rango de edades as\u00ed como lesiones post m\u00f3rtem, no se objetivaron diferencias en la inmunorreactividad para cox-2 que hicieran posible su uso como marcador de vitalidad. La expresi\u00f3n de cox-2 se produjo en c\u00e9lulas mononucleares, presentes de manera incidental en la piel resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 9 (tres heridas de 3 minutos, 30 minutos y 4 horas de evoluci\u00f3n), y en las lesiones antiguas en cicatrizaci\u00f3n (con edad de 0.5 a 3 meses). un hallazgo significativo fue la discrepancia en el patr\u00f3n de inmunotinci\u00f3n de cox-2 en la piel normal que podemos observar en los diferentes trabajos y tambi\u00e9n constatamos en nuestros resultados. Se ha descrito positividad para cox-2 en epidermis, anejos d\u00e9rmicos, endotelio y fibroblastos en los distintos estudios (abd-el- aleem y cols. 2001; futagami y cols. 2002). Nosotros encontramos expresi\u00f3n normal en gl\u00e1ndulas sudor\u00edparas ecrinas y, con tinci\u00f3n d\u00e9bil, en gl\u00e1ndulas seb\u00e1ceas y la capa basal de la epidermis. 4.- Mol\u00e9culas de adhesi\u00f3n: cadherina e y cateninas; selectina p. 4.1.- Cadherina e y cateninas. el an\u00e1lisis ihq de cadherinas y cateninas podr\u00eda ser \u00fatil para demostrar el comienzo de la reepitelizaci\u00f3n que, mediante histolog\u00eda de rutina, no se objetiva hasta los 3-6 d\u00edas. Por ello, hemos investigado si existen cambios detectables mediante ihq en la expresi\u00f3n de cadherina e y las tres cateninas (\u00c2\u00bf, \u00edY y \u00c2\u00bf) en heridas cut\u00e1neas, vitales y post m\u00f3rtem, de horas de evoluci\u00f3n (en las vitales, desde 55 minutos a 8 horas y en las post m\u00f3rtem, de 15 a 180 minutos). El m\u00e9todo ha permitido demostrar de manera eficaz las cuatro mol\u00e9culas en la epidermis normal con un patr\u00f3n intercelular o paramembranoso respectivamente, pero no se han encontrado en las heridas cambios \u00fatiles para el diagn\u00f3stico: las diferencias sutiles de inmunotinci\u00f3n que hemos observado en 11 de los 42 casos estudiados (9 heridas vitales y 2 post m\u00f3rtem) al comparar el margen de la herida con el otro borde de la muestra, no estaban relacionados con el tipo de lesi\u00f3n (vital o post m\u00f3rtem), la edad de la herida ni el tipo de borde. estos resultados se podr\u00edan explicar por una sensibilidad relativamente baja de la t\u00e9cnica ihq o el tiempo corto de evoluci\u00f3n de nuestros casos. 4.2.- Selectina p. la selectina p ha sido investigada desde el punto de vista de la patolog\u00eda forense por el grupo de dressler que ha descrito la expresi\u00f3n de este marcador en heridas vitales de 3 minutos a 7 horas de evoluci\u00f3n y no en las lesiones post m\u00f3rtem (dressler y cols. 1998). Estos autores analizaron mediante ihq el porcentaje de vasos que expresaban selectina p comparando heridas vitales con muestras de piel sana de los resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 10 mismos individuos. Nuestro m\u00e9todo ha sido diferente, centr\u00e1ndonos en el estudio del borde de la herida y considerando como control el margen opuesto de la muestra, siguiendo una aproximaci\u00f3n al problema similar a la de los estudios sobre la fn y otros marcadores (betz y cols. 1992). Para ello valoramos de manera semicuantitativa el porcentaje de peque\u00f1os vasos que expresaban selectina p sobre el total determinado con tinci\u00f3n con un marcador endotelial como es cd31. Analizamos ambos bordes (la herida y el opuesto) y calculamos la relaci\u00f3n entre ambos porcentajes. En nuestra serie hemos encontrado resultados muy variables para este \u00edndice en ambos m\u00e1rgenes: en heridas vitales oscilaba entre 10.7  71.4 en el borde de herida y 12.5 58.8 en el opuesto. En heridas post m\u00f3rtem el \u00edndice variaba entre 22.5 69.2 y 28 &#8211; 89.5, respectivamente. Cuando determinamos la relaci\u00f3n entre ambos porcentajes no encontramos diferencias estad\u00edsticamente significativas entre las heridas vitales y las post m\u00f3rtem. Las diferencias en los n\u00fameros absolutos se deben, probablemente, al distinto tama\u00f1o de las muestras por su forma de obtenci\u00f3n, siendo m\u00e1s gruesas las procedentes de necropsia. una discrepancia m\u00e1s significativa con el estudio de dressler y cols. Fue la presencia de inmunorreactividad para selectina p en las muestras de piel de cad\u00e1ver en nuestra serie mientras que dichos autores se\u00f1alan que no detectaron selectinas en el 90% de las heridas inducidas post m\u00f3rtem, refiriendo \u00fanicamente tinci\u00f3n de baja intensidad para la selectina p en el 13% de los vasos (dressler y cols. 1998). 5.- Influencia de autolisis y putrefacci\u00f3n en los resultados de ihq. uno de los factores cr\u00edticos en los resultados de las t\u00e9cnicas de ihq es la calidad de la fijaci\u00f3n del tejido, que incluye la ausencia de fen\u00f3menos de autolisis y putrefacci\u00f3n. la influencia de estos fen\u00f3menos en los resultados de ihq var\u00eda seg\u00fan el marcador analizado, entre otros factores, y ha sido analizada en dos de nuestros estudios. pr\u00e1cticamente en todos nuestros casos en los que se indujo el artefacto desapareci\u00f3 la inmunorreactividad para fn. Estos resultados son similares a los de betz y cols. Que tambi\u00e9n refieren una disminuci\u00f3n de la tinci\u00f3n de fn en la piel que sufri\u00f3 putrefacci\u00f3n (betz y cols. 1993). en el caso de la tn, el an\u00e1lisis del artefacto de autolisis y putrefacci\u00f3n no fue posible porque ya no hab\u00eda expresi\u00f3n de la mol\u00e9cula en las muestras bien conservadas. resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 11 en nuestro estudio de la selectina p, se ponen de manifiesto las diferencias dependiendo de la prote\u00edna analizada, puesto que para este anticuerpo s\u00ed se conservaba la inmunorreactividad. Sin embargo, en la mayor\u00eda de los casos aparecieron dos de los problemas habituales en el tejido mal fijado: la positividad fue m\u00e1s d\u00e9bil y apareci\u00f3 tinci\u00f3n de fondo. Adem\u00e1s todas las muestras presentaron mayor disrupci\u00f3n tisular, probablemente en relaci\u00f3n con la menor resistencia de los tejidos autolizados al tratamiento de desenmascaramiento antig\u00e9nico (calentamiento en olla a presi\u00f3n). estos artefactos hacen muy dif\u00edcil una valoraci\u00f3n microsc\u00f3pica ya de por s\u00ed compleja y subjetiva, y en estas circunstancias fue pr\u00e1cticamente imposible hacer una determinaci\u00f3n semicuantitativa de vasos positivos. conclusiones 1.- La ihq puede ayudar al diagn\u00f3stico de vitalidad de las heridas cut\u00e1neas incisas pero presenta importantes limitaciones. Es necesario el uso de varios marcadores, la comparaci\u00f3n del borde de la herida con un control y se tendr\u00e1n m\u00e1s en cuenta los resultados positivos que los negativos. 2.- El an\u00e1lisis de la fn es \u00fatil para el diagn\u00f3stico de vitalidad de las heridas, pero la inmunorreactividad en las lesiones vitales no es tan precoz ni tan frecuente como se ha descrito, existiendo adem\u00e1s heterogeneidad en la tinci\u00f3n entre diferentes secciones de un mismo caso. Las \u00e1reas de hemorragia dificultan la interpretaci\u00f3n y pueden generar falsos positivos. 3.- El estudio de la tn no revel\u00f3 sobreexpresi\u00f3n en heridas de corta evoluci\u00f3n por lo que este marcador no es \u00fatil, siendo positivo s\u00f3lo en cicatrices. 4.- En la rata se han encontrado diferencias de tinci\u00f3n ihq para fn y tn: aunque se observ\u00f3 el patr\u00f3n reticular de reacci\u00f3n vital, fue menos espec\u00edfico y se present\u00f3 en algunos casos post m\u00f3rtem. En el tejido muscular, la positividad intracelular ocurri\u00f3 con frecuencia similar en heridas vitales y post m\u00f3rtem, por lo que no es posible el diagn\u00f3stico diferencial. 5.- La detecci\u00f3n de apoptosis en la piel mediante t\u00e9cnica de marcaje in situ de fragmentos de adn, ha mostrado resultados m\u00e1s concluyentes en la epidermis que en la dermis y puede ser un marcador de vitalidad. Debido a los problemas de especificidad del m\u00e9todo se requiere confirmaci\u00f3n de los resultados mediante estudios adicionales. El an\u00e1lisis ihq de bcl-2 y caspasa-3 no ha sido \u00fatil para dicha finalidad. 6.- El estudio ihq de cox-2 no sirve para el diagn\u00f3stico de vitalidad de heridas cut\u00e1neas incisas. La expresi\u00f3n de cox-2 est\u00e1 relacionada con la presencia de infiltrado resumen tesis doctoral jos\u00e9 antonio ortiz rey 12 inflamatorio linfoc\u00edtico o histiocitario, por lo que ser\u00eda m\u00e1s caracter\u00edstica de lesiones de tiempo largo de evoluci\u00f3n. 7.- El an\u00e1lisis ihq de la cadherina e y de las cateninas \u00c2\u00bf, \u00edY y \u00c2\u00bf, no ha mostrado que sean \u00fatiles como marcadores de vitalidad. 8.- La evaluaci\u00f3n ihq de la selectina p mediante la comparaci\u00f3n del borde de la herida con el margen opuesto de la muestra, no ha sido \u00fatil para el diagn\u00f3stico de vitalidad. Adem\u00e1s el porcentaje de vasos que expresan selectina presenta gran variabilidad interindividual. 9.- La influencia de la autolisis y la putrefacci\u00f3n en los resultados de ihq var\u00eda seg\u00fan el marcador. Se observ\u00f3 p\u00e9rdida de inmunorreactividad para fn mientras que se conserv\u00f3 para selectina p, aunque la intensidad fue d\u00e9bil y la tinci\u00f3n de fondo y la fragmentaci\u00f3n del tejido hicieron pr\u00e1cticamente imposible la valoraci\u00f3n microsc\u00f3pica. bibliograf\u00eda (por orden alfab\u00e9tico): abd-el-aleem sa, ferguson mwj, appleton i, bhowmick a, mccollum cn, ireland gw (2001). Expression of cyclooxygenase isoforms in normal human skin and chronic venous ulcers. J pathol 195: 616-623. betz p (1996). Collagen subtypes markers for the healing of skin wounds. en: oehmichen m, kirchner h (eds). The wound healing process forensic pathological aspects. Schmidt-r\u00ed\u00b6mhild, l\u00ed\u00bcbeck, pp 247-256. betz p, nerlich a, t\u00ed\u00bcbel j, wiest i, hausmann r (1997). Detection of cell death in human skin wounds of various ages by an in situ end labeling of nuclear dna fragments. 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Forensic sci int 108: 187-203.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Aplicaci\u00f3n de la inmunohistoqu\u00edmica al diagn\u00f3stico de vitalidad en las heridas cut\u00e1neas incisas<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Aplicaci\u00f3n de la inmunohistoqu\u00edmica al diagn\u00f3stico de vitalidad en las heridas cut\u00e1neas incisas <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Jos\u00e9 Antonio Ortiz Rey <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Santiago de compostela<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 23\/10\/2009<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>Jos\u00e9 Manuel Suarez Pe\u00f1aranda<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: jeronimo Forteza vila <\/li>\n<li>Marta Ca\u00f1amero (vocal)<\/li>\n<li>joaqu\u00edn [ Gonz\u00e1lez-carrer\u00f3 foj\u00f3n (vocal)<\/li>\n<li>pilar San Miguel fraile (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Jos\u00e9 Antonio Ortiz Rey Justificaci\u00f3n y objetivos el diagn\u00f3stico de vitalidad de las heridas cut\u00e1neas es un [&hellip;]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"default","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center 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