{"id":96901,"date":"2018-03-11T10:17:16","date_gmt":"2018-03-11T10:17:16","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/utilizacion-de-la%c2%adneas-celulares-de-oncorhynchus-mykiss-para-el-estudio-de-la-accion-y-para-la-seleccion-de-agentes-inmunoestimulantes-utilizables-en-acuicultura\/"},"modified":"2018-03-11T10:17:16","modified_gmt":"2018-03-11T10:17:16","slug":"utilizacion-de-la%c2%adneas-celulares-de-oncorhynchus-mykiss-para-el-estudio-de-la-accion-y-para-la-seleccion-de-agentes-inmunoestimulantes-utilizables-en-acuicultura","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/inmunopatologia\/utilizacion-de-la%c2%adneas-celulares-de-oncorhynchus-mykiss-para-el-estudio-de-la-accion-y-para-la-seleccion-de-agentes-inmunoestimulantes-utilizables-en-acuicultura\/","title":{"rendered":"Utilizaci\u00f3n de l\u00edneas celulares de oncorhynchus mykiss para el estudio de la acci\u00f3n y para la selecci\u00f3n de agentes inmunoestimulantes utilizables en acuicultura"},"content":{"rendered":"

Tesis doctoral de Mar\u00eda Camino Fierro Castro <\/strong><\/h2>\n

Debido a su creciente impacto econ\u00f3mico y social, existe un enorme inter\u00e9s en el desarrollo de la acuicultura, lo que ha producido un gran avance en los estudios sobre la biolog\u00eda de las especies cultivadas o que est\u00e1n en proceso de adaptaci\u00f3n a su producci\u00f3n. la acuicultura no est\u00e1 exenta de problemas, el m\u00e1s importante de ellos es el desarrollo de enfermedades infecciosas en las piscifactor\u00edas causantes de amplias p\u00e9rdidas. dado los problemas medioambientales y para la salud de los consumidores que se derivan del uso de productos antimicrobianos y antiparasitarios (antibi\u00f3ticos, desinfectantes…) En la acuicultura, se hace necesario usar m\u00e9todos que incrementen la resistencia natural o adquirida frente a los pat\u00f3genos. Por ello el conocimiento del sistema inmunitario de los peces es clave para el desarrollo de una acuicultura sostenible. Es necesario comprender c\u00f3mo se desarrollan las respuestas inmunitarias en los peces y as\u00ed poder utilizar sus propios mecanismos de defensa para controlar las enfermedades infecciosas ya sea mediante vacunaci\u00f3n o inmunoestimulaci\u00f3n. las t\u00e9cnicas de inmunoprofilaxis, como la vacunaci\u00f3n y la inmunoestimulaci\u00f3n, son t\u00e9cnicas con grandes perspectivas en la acuicultura, y est\u00e1n desplazando a los m\u00e9todos tradicionales basados en la quimioterapia. Sin embargo, todav\u00eda existen algunas enfermedades contra las que no se dispone de vacunas efectivas, como son las producidas por virus y otros pat\u00f3genos intracelulares. Especialmente, algunas bacterias que son pat\u00f3genos intracelulares facultativos parecen capaces de escapar a la acci\u00f3n de agentes quimioterape\u00faticos o vacunas y, en ciertas circunstancias, p. E. En condiciones de estr\u00e9s, los peces portadores sufren y transmiten la enfermedad. los inmunoestimulantes pueden tener una funci\u00f3n importante en la protecci\u00f3n contra estas patolog\u00edas, incrementando las respuestas inmunol\u00f3gicas espec\u00edficas e inespec\u00edficas, pero especialmente las celulares implicadas en las respuestas defensivas. En mam\u00edferos, algunos inmunoestimulantes, tales como el levamisol, \u00edY-glucanos y lps, activan las respuestas inmunocelulares, mientras que otros, como rnas bicatenarios y los polinucle\u00f3tidos (poli(i) – poli(c), inducen la producci\u00f3n de interfer\u00f3n, que es una de las principales citoquinas implicadas en la defensa anti-viral. la existencia de respuestas semejantes frente a inmunoestimulantes tambi\u00e9n ha sido puesta de manifiesto en peces, en los que se ha demostrado la expresi\u00f3n de actividad de distintas citoquinas, como maf, mif, interfer\u00f3n y tnf. Tambi\u00e9n estos productos activan la producci\u00f3n de metabolitos oxidativos, como el \u00f3xido n\u00edtrico, que parecen tener una funci\u00f3n importante en el control de pat\u00f3genos intracelulares como r. Salmoninarum. algunos inmunoestimulantes est\u00e1n ya disponibles para su uso comercial, como el m-glucano (un \u00edY-glucano), pero muchos no han sido a\u00fan ensayados in vivo. Adem\u00e1s, los poli(i) – poli(c) que inducen actividad interfer\u00f3n en salm\u00f3nidos y protecci\u00f3n frente a virus, no han sido utilizados como inmunoestimulantes frente a otras patolog\u00edas no v\u00edricas y, por el contrario, el levamisol ha sido ensayado frente a patolog\u00edas bacterianas pero no frente a las v\u00edricas. un problema asociado a la experimentaci\u00f3n en peces es la elevada variabilidad de las respuestas, en funci\u00f3n de la especie, condiciones ambientales en el origen de captura y\/o de mantenimiento. Frente a estos problemas, la experimentaci\u00f3n in vitro presenta numerosas ventajas, tales como condiciones controladas y repetitivas, la posibilidad de realizar numerosos ensayos repetitivos y en tiempos cortos, con una menor variaci\u00f3n individual. por otra parte, el desarrollo de m\u00e9todos de ensayos in vitro son parte fundamental de la pol\u00edtica de las 3rs (reducci\u00f3n, refinamiento y reemplazamiento) para optimizar o reemplazar el uso de animales, seg\u00fan establece la legislaci\u00f3n espa\u00f1ola y comunitaria. para el estudio de la acci\u00f3n de los inmunoestimulantes ha predominado el uso de sistemas de ensayos que incluyen cultivos primarios de leucocitos y tejidos, as\u00ed como el uso de l\u00edneas celulares. Generalmente, los cultivos celulares que se han utilizado constituyen cultivos en monocapa (bidimensionales) ricos en un \u00fanico tipo celular y que presenta ventajas para la manejabilidad y repetitividad del modelo. sin embargo, su uso no es apropiado cuando se trata de establecer modelos que se asemejan en su comportamiento a la situaci\u00f3n in vivo. As\u00ed, hoy en d\u00eda se reconoce que sistemas m\u00e1s complejos, que incluyen varios tipos celulares y cultivos tridimensionales que pueden dar lugar a modelos histot\u00edpicos u organot\u00edpicos, son mejores sistemas de ensayo para predecir resultados in vivo. Estos modelos m\u00e1s complejos permiten que se establezcan interrelaciones celulares tanto f\u00edsicas como mediadas por factores humorales (redes de citoquinas y otros factores). dentro del grupo de trabajo donde se ha llevado acabo esta tesis doctoral, se han desarrollado 2 l\u00edneas celulares del estroma de pronefros (tps-2) y del estroma de bazo (tss) de trucha arco iris, que est\u00e1n siendo usadas para diversos estudios de patolog\u00eda in vitro y la selecci\u00f3n de preparados antig\u00e9nicos para vacunas en peces. Ambas l\u00edneas est\u00e1n formadas por poblaciones celulares heterog\u00e9neas de tipo ret\u00edculo-endotelial que muestran actividad angiog\u00e9nica in vitro y actividad macrof\u00e1gica. en base a esto el prop\u00f3sito de esta tesis ha sido: \u00abanalizar la utilizaci\u00f3n de los cultivos celulares y de los ensayos in vitro para el estudio y selecci\u00f3n de substancias candidatas a ser inmunoestimulantes para su uso en acuicultura\u00bb para ello se plantearon los siguientes objetivos: \u00c2\u00bfinvestigar en las l\u00edneas celulares tps-2 y tss de o. Mykiss las respuestas inducidas por la exposici\u00f3n a inmunoestimulantes conocidos (lps, levamisol y poly i:c), mediante: a. Ensayos biol\u00f3gicos in vitro para determinar los efectos potenciadores de las respuestas inmunitarias innatas. b. An\u00e1lisis de la expresi\u00f3n de genes inmunorreguladores implicados en las respuestas pro-inflamatorias. \u00c2\u00bfcomparar los resultados obtenidos en las l\u00edneas tps-2 y tss con los observados en cultivos primarios de macr\u00f3fagos de esa especie. en cuanto a los productos utilizados como inmunoestimulantes, se seleccionaron tres que hab\u00edan sido previamente bien caracterizados, tanto en estudios in vivo como in vitro, en peces: lps, poly i:c y el levamisol . un factor importante a la hora de utilizar inmunoestimulantes son las dosis y el tiempo de exposici\u00f3n, para lo cual se tuvieron en cuenta resultados previos descritos por otros autores. para el desarrollo de los objetivos planteados se ha estudiado la actividad fagoc\u00edtica, la explosi\u00f3n respiratoria (uno de los mecanismos m\u00e1s importantes de la respuesta inmunitaria innata), la detecci\u00f3n de factores liberados activantes de macr\u00f3fagos maf, y la producci\u00f3n de \u00f3xido n\u00edtrico que puede actuar como compuesto microbicida. Adem\u00e1s tambi\u00e9n se analiz\u00f3 los niveles de expresi\u00f3n de los principales genes que interviene en las respuestas inmunitarias como son las citoquinas: interleuquina 1\u00edY (il-1\u00edY), la quimioquina il-8, el factor de necrosis tumoral \u00c2\u00bf1 y \u00c2\u00bf2 (tnf-\u00c2\u00bf) o la prote\u00edna mx-1 inducible por inf y la prote\u00edna de la cadena \u00edY del complejo principal de histocompatibilidad (mhc-ii) que interviene en la respuestas inmunitarias estimulando la respuesta humoral espec\u00edfica de peces; as\u00ed como tambi\u00e9n se analizaron la expresi\u00f3n de las enzimas ciclooxigenasa (cox-2), \u00f3xido n\u00edtrico sintasa inducible inos, y la arginasa. Estos ensayos se llevaron acabo inicialmente para la puesta a punto de la t\u00e9cnica mediante rt-pcr y an\u00e1lisis semicuantitativo por densitometr\u00eda de las bandas de dna de los geles de agarosa y finalmente se validaron los resultados mediante qpcr o pcr a tiempo real. tras los ensayos realizamos concluimos: 1.- Las l\u00edneas celulares tss y tps-2, derivadas respectivamente del estroma del bazo y del pronefros de oncorynchus mykiss, al igual que los cultivos primarios de macr\u00f3fagos, responden a la exposici\u00f3n a los inmunoestimulantes lps, levamisol y poly i:c y a actividad maf incrementando la fagocitosis y la producci\u00f3n de radicales oxidativos, que son algunos de los mecanismos de defensa innata que se producen in vivo tras la inmunoestimulaci\u00f3n. Por lo tanto, para salm\u00f3nidos, ambas l\u00edneas celulares pueden ser utilizadas como modelos para la experimentaci\u00f3n in vitro que implique ensayos biol\u00f3gicos para esas actividades de la inmunidad innata. 2.- Dichas l\u00edneas celulares estrom\u00e1ticas son capaces de elaborar respuestas de tipo proinflamatorio tras la exposici\u00f3n a los inmunoestimulantes lps, levamisol y poly i:c, como demuestra la activaci\u00f3n de la expresi\u00f3n g\u00e9nica de las enzimas inducibles cox-2, inos y arginasa-2, de las citoquinas il-1 \u00edY, tnf- \u00c2\u00bf, il-8, de la prote\u00edna mx-1 inducible por interfer\u00f3n y de la cadena \u00edY del mhc-ii de o. Mykiss. En consecuencia, para salm\u00f3nidos, las dos l\u00edneas celulares pueden ser utilizadas como modelos para la experimentaci\u00f3n in vitro que implique ensayos de expresi\u00f3n de genes inmunorreguladores de las respuestas inflamatorias. 3.- Tanto en los ensayos biol\u00f3gicos como en los de expresi\u00f3n de genes inmunorreguladores, las respuestas de las l\u00edneas celulares estrom\u00e1ticas tss y tps 2 para cada inmunoestimulante difieren cualitativa y cuantitativamente de las observadas en los cultivos primarios de macr\u00f3fagos para ese mismo inmunoestimulante. Este hecho indica la existencia de procesos de modulaci\u00f3n de las respuestas, que se pueden atribuir a las interacciones entre poblaciones celulares heterog\u00e9neas presentes en las l\u00edneas celulares. 4.- El conjunto de los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que las l\u00edneas celulares tss y tps-2, que originan cultivos con caracter\u00edsticas histot\u00edpicas, pueden ser utilizadas como modelos alternativos a la experimentaci\u00f3n in vivo, as\u00ed como a los cultivos primarios de macr\u00f3fagos (que requieren el uso continuo de animales para su obtenci\u00f3n), para realizar ensayos biol\u00f3gicos y de expresi\u00f3n de genes inmunorreguladores in vitro que estudien el efecto de productos inmunoestimulantes sobre la activaci\u00f3n de mecanismos de defensa innata y proinflamatorios en salm\u00f3nidos.<\/p>\n

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Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00abUtilizaci\u00f3n de l\u00edneas celulares de oncorhynchus mykiss para el estudio de la acci\u00f3n y para la selecci\u00f3n de agentes inmunoestimulantes utilizables en acuicultura<\/strong>\u00ab<\/h3>\n
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  • T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Utilizaci\u00f3n de l\u00edneas celulares de oncorhynchus mykiss para el estudio de la acci\u00f3n y para la selecci\u00f3n de agentes inmunoestimulantes utilizables en acuicultura <\/li>\n
  • Autor:<\/strong>\u00a0 Mar\u00eda Camino Fierro Castro <\/li>\n
  • Universidad:<\/strong>\u00a0 Le\u00f3n<\/li>\n
  • Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 30\/10\/2009<\/li>\n<\/ul>\n

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    Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n
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    • Director de la tesis<\/strong>\n
        \n
      • Alberto Jose Villena Cortes<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n
      • Tribunal<\/strong>\n
          \n
        • Presidente del tribunal: Jes\u00fas Lamas fern\u00e1ndez <\/li>\n
        • Mar\u00eda luz Diago ega\u00f1a (vocal)<\/li>\n
        • Mar\u00eda amparo Estepa perez (vocal)<\/li>\n
        • ant\u00f3nio Manuel Dos santos afonso (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n

           <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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