{"id":99507,"date":"2010-03-03T00:00:00","date_gmt":"2010-03-03T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/sin-categoria\/construccion-y-deconstruccion-de-la-cadena-de-transporte-electronico-mitocondrial\/"},"modified":"2010-03-03T00:00:00","modified_gmt":"2010-03-03T00:00:00","slug":"construccion-y-deconstruccion-de-la-cadena-de-transporte-electronico-mitocondrial","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.deberes.net\/tesis\/ciencias-de-la-vida\/construccion-y-deconstruccion-de-la-cadena-de-transporte-electronico-mitocondrial\/","title":{"rendered":"Construcci\u00f3n y deconstrucci\u00f3n de la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial"},"content":{"rendered":"<h2>Tesis doctoral de <strong> Ester Perales Clemente <\/strong><\/h2>\n<p>El sistema de fosforilaci\u00f3n oxidativa o sistema oxphos est\u00e1 formado por cinco complejos multiprot\u00e9icos que suman un total de 89 subunidades diferentes. La peculiaridad de este sistema es que sus subunidades se encuentran codificadas en distintos compartimentos celulares, es decir, 13 prote\u00ednas se encuentran codificadas en el dna mitocondrial, mientras que el resto son codificadas en el n\u00facleo. El doble origen gen\u00e9tico del sistema oxphos implica una comunicaci\u00f3n estrecha y muy regulada entre el n\u00facleo y la mitocondria. As\u00ed pues, la construcci\u00f3n de la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial, indica el orden y las diversas asociaciones que se han de establecer entre las distintas subunidades para ensamblar los complejos que componen este sistema, con arreglo a las leyes de la naturaleza. desde hace m\u00e1s de una d\u00e9cada, nuestro laboratorio ha trabajado arduamente en la generaci\u00f3n de distintas l\u00edneas celulares de rat\u00f3n mutantes en diversos genes mitocondriales, con el fin inicial de generar modelos animales para el estudio de las enfermedades mitocondriales. La caracterizaci\u00f3n y el estudio minucioso de cuatro l\u00edneas celulares mutantes en tres genes mitocondriales (mt-nd4, mt-nd5 y mt-nd6), han permitido establecer el orden de entrada de las siete subunidades mitocondriales (nd1-6, nd4l) en la ruta de ensamblaje del complejo i. Para ello, se han utilizado t\u00e9cnicas de marcaje radioactivo espec\u00edfico de las subunidades mitocondriales, su seguimiento en la incorporaci\u00f3n a los subcomplejos y formaci\u00f3n de los complejos respiratorios, mediante t\u00e9cnicas de blue-native. Es decir, nuestro trabajo aporta nuevas evidencias de c\u00f3mo se construye el complejo i en la membrana interna mitocondrial. Un mejor conocimiento de este proceso puede ser \u00fatil para entender la base molecular de muchas deficiencias asociadas con alteraciones en dicho complejo. Nuestro trabajo contribuye a solucionar la inc\u00f3gnita, hasta la fecha sin resolver, de c\u00f3mo se incorporan las subunidades codificadas en el mtdna en la ruta de ensamblaje del complejo i. De acuerdo con nuestros resultados, las subunidades nd1 y nd2 se incorporan en diferentes m\u00f3dulos de ensamblaje, siendo \u00e9stas la primera y la segunda subunidades mitocondriales en incorporarse, respectivamente. La subunidad nd4 es esencial para la maduraci\u00f3n del subcomplejo del brazo de membrana, constituyendo \u00e9sta la tercera entrada de las subunidades mitocondriales. Sin embargo, la ausencia de nd4, permite el ensamblaje de los intermedios que contienen la subunidad del brazo perif\u00e9rico ndufs3. Estos resultados argumentan a favor del ensamblaje de un fragmento del brazo perif\u00e9rico que se ancla en la membrana a trav\u00e9s de nd1 y es independiente de la mayor parte del brazo de membrana. La subunidad nd6 es necesaria para que los subcomplejos del brazo de membrana y brazo perif\u00e9rico se unan, siendo \u00e9ste el cuarto punto de entrada de las subunidades mitocondriales. Finalmente, la \u00faltima en incorporarse ser\u00eda la subunidad nd5, representado la quinta entrada en la ruta de ensamblaje.  una vez abordado el estudio del ensamblaje del complejo i de la cadena de transporte electr\u00f3nico, la siguiente aproximaci\u00f3n fue intentar prescindir de la localizaci\u00f3n mitocondrial de los genes codificados en el mtdna, para evaluar su aplicabilidad a la terapia de las enfermedades mitocondriales. Lo que dio lugar al primer reto tecnol\u00f3gico abordado en esta tesis, la expresi\u00f3n en el citoplasma de las prote\u00ednas codificadas en el mtdna y su posterior importe a la mitocondria: expresi\u00f3n alot\u00f3pica. Dicha estrategia se enfrenta con dos problemas importantes: el primero es la necesaria recodificaci\u00f3n de los genes desde el c\u00f3digo gen\u00e9tico mitocondrial al universal, y el segundo, m\u00e1s relevante, la alta hidrofobicidad de las prote\u00ednas codificadas en el mtdna que impide su correcto importe a la mitocondria, en la mayor\u00eda de los casos evaluados. Nuestro trabajo ha intentado explorar el potencial de esta aproximaci\u00f3n experimental mediante la expresi\u00f3n alot\u00f3pica de mt-nd6 en una l\u00ednea celular mutante en dicho gen, generada en nuestro laboratorio. Los resultados obtenidos nos llevan a plantear a la comunidad cient\u00edfica una llamada de atenci\u00f3n, en el sentido de extremar la precauci\u00f3n a la hora de interpretar los resultados. Aunque nuestros resultados no se puedan extrapolar directamente a otras mutaciones diferentes, ponen de manifiesto que es necesario realizar una serie de controles que demuestren que el rescate de la funci\u00f3n mitocondrial se debe a la prote\u00edna expresada alot\u00f3picamente, y no a una reversi\u00f3n en la mutaci\u00f3n original. Debido a que con menos del 10 % de la secuencia de mt-nd6 silvestre se ensamblan niveles casi normales de complejo i, tal tasa de reversi\u00f3n no se detecta mediante secuenciaci\u00f3n y puede llevar a conclusiones err\u00f3neas, si no se realizan los controles adecuados. aunque la funci\u00f3n m\u00e1s conocida de la mitocondria es la generaci\u00f3n de atp a trav\u00e9s de la fosforilaci\u00f3n oxidativa, el sistema oxphos lo podemos deconstruir en 3 procesos fundamentales: el primero es la transferencia de electrones desde el nadh o el fadh2 hasta el o2 para producir h2o, realizado por la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial (complejos i, ii, iii y iv). Durante este proceso, algunos electrones pueden desviarse de su ruta, reaccionando directamente con el o2 dando lugar a especies reactivas de ox\u00edgeno (ros). La energ\u00eda que se libera en la transferencia de electrones sirve para llevar a cabo el segundo de los procesos del sistema oxphos: el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana a trav\u00e9s de los complejos i, iii y iv, dando lugar a la fuerza prot\u00f3n-motriz (proton motriz force pmf), crucial para la s\u00edntesis de atp (tercer proceso del sistema oxphos), pero tambi\u00e9n necesaria para realizar una gran variedad de procesos dependientes de energ\u00eda. Estos procesos dependen del potencial de membrana o del gradiente de h+. Por ejemplo, la entrada de ca2+, el intercambio atp\/adp mediante la nucle\u00f3tido de adenina translocasa (ant), el flujo de na+ y k+ a trav\u00e9s de la membrana interna mitocondrial y el importe de precursores prot\u00e9icos . Sin embargo, los antiportes mitocondriales (aspartato\/glutamato, h+\/k+, h+\/na+, 2h+\/ca2+) y los simportes (h+\/piruvato y pi\/adp) son dependientes de la variaci\u00f3n de ph. El tercer proceso del sistema oxphos consiste en utilizar la energ\u00eda electroqu\u00edmica, inherente a la diferencia en concentraci\u00f3n de protones y a la separaci\u00f3n de cargas a trav\u00e9s de la membrana interna mitocondrial, para impulsar la s\u00edntesis de atp conforme los protones fluyen a favor de gradiente de vuelta hacia la matriz a trav\u00e9s de la atp sintasa o complejo v. la transferencia de electrones y la s\u00edntesis de atp est\u00e1n acopladas en mitocondrias sanas. Existen ciertas situaciones fisiol\u00f3gicas en las que este acoplamiento se modifica de forma controlada. El gradiente electroqu\u00edmico generado entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana puede disiparse en forma de calor, a trav\u00e9s de las prote\u00ednas ucp (uncoupling protein), proceso fundamental en la termorregulaci\u00f3n de los mam\u00edferos y otros seres vivos. El desacoplamiento entre la transferencia de electrones y la s\u00edntesis de atp es un fen\u00f3meno que se produce en la naturaleza no s\u00f3lo en la termorregulaci\u00f3n, sino tambi\u00e9n mediante enzimas alternativas al paso de electrones como la nadh deshidrogenasa alternativa (ndi1) y la oxidasa alternativa (aox) que se encuentran presentes hongos, plantas y animales inferiores, coexistiendo incluso con la cadena de transporte electr\u00f3nico como es el caso de la levadura yarrowia lipolytica .  uno de los objetivos de este trabajo ha sido el an\u00e1lisis de los elementos que constituyen el sistema oxphos, y en concreto la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial y sus funciones. Para ello, hemos realizado el dise\u00f1o de sistemas in vivo para entender cada uno de los procesos de la cadena y para responder por qu\u00e9 en mam\u00edferos este sistema se encuentra integrado y cu\u00e1l de dichos procesos es cr\u00edtico en diferentes situaciones. Para ello tuvimos que desarrollar el segundo reto tecnol\u00f3gico de esta tesis: la xenoexpresi\u00f3n (xeno- significa extranjero, expresi\u00f3n de una prote\u00edna de un organismo en otro) de enzimas alternativos del sistema oxphos. hemos deconstruido la cadena de transporte electr\u00f3nico parcialmente, es decir, la hemos analizado tomando como eje clave en el estudio uno de los transportadores m\u00f3viles de electrones: la ubiquinona. As\u00ed hemos dividido la cadena en dos partes: reducci\u00f3n y oxidaci\u00f3n de la ubiquinona.  nuestras l\u00edneas celulares mutantes en complejo i, cuya mutaci\u00f3n impide el ensamblaje del mismo, nos ofrecen el modelo de estudio ideal para este an\u00e1lisis. La ubiquinona no puede ser reducida por el complejo i, solamente puede ser oxidada por la acci\u00f3n combinada de los complejos iii y iv. . La enzima monopept\u00eddica ndi1 de saccharomyces cerevisiae, capta los electrones del nadh y los cede a la ubiquinona aunque sin bombear protones al espacio intermembrana, es decir, es capaz de cumplir parcialmente la funci\u00f3n del complejo i (formado por 45 subunidades en mam\u00edferos). De hecho, algunos autores la proponen como mol\u00e9cula terap\u00e9utica en deficiencias en complejo i.  en este trabajo hemos confirmado que la expresi\u00f3n de ndi1 en l\u00edneas celulares de rat\u00f3n mutantes en complejo i, es capaz de restaurar la oxidaci\u00f3n del nadh. De hecho, nuestras l\u00edneas celulares que expresan la enzima de levadura: nd6kondi1 y nd4kondi1, sobreviven indefinidamente en un medio no fermentable, a diferencia de lo observado por otros autores, que s\u00f3lo demuestran supervivencia durante 10 d\u00edas. Esto se debe a la correcta integraci\u00f3n de la prote\u00edna con el resto de los complejos de la cadena y al bombeo de protones a trav\u00e9s de los complejos iii y iv, necesario para la s\u00edntesis de atp por el complejo v.  por otra parte, las l\u00edneas celulares mutantes en complejo iii o iv no son capaces de oxidar la ubiquinona, siendo id\u00f3neas como modelo para deconstruir la segunda parte de la cadena.  Como consecuencia de la incapacidad para oxidar la ubiquinona, dichas l\u00edneas celulares s\u00f3lo pueden mantenerse en cultivo tras la adici\u00f3n de uridina al medio de cultivo. En nuestro trabajo hemos demostrado, c\u00f3mo en presencia de una enzima monopept\u00eddica de hongos, plantas y animales inferiores, denominada oxidasa alternativa (aox), las c\u00e9lulas carentes de complejo iii o iv son capaces se sobrevivir en ausencia de uridina. Esta enzima es capaz de transferir los electrones desde coq al ox\u00edgeno, sustituyendo as\u00ed la acci\u00f3n combinada de los complejos iii y iv, y permitiendo el correcto funcionamiento de la enzima dihidroorotato deshidrogenasa, implicada en la s\u00edntesis de pirimidinas. Una caracter\u00edstica fundamental de aox es su incapacidad para bombear protones al espacio intermembrana, por tanto la energ\u00eda que se produce en la transferencia de electrones se disipa en forma de calor, caracter\u00edstica que le sirve para cumplir una de sus principales funciones en plantas: la regulaci\u00f3n de la termog\u00e9nesis. Hemos comprobado que dicha enzima no resulta t\u00f3xica expresada en c\u00e9lulas control de rat\u00f3n, confirmando los resultados obtenidos previamente por otros autores, en c\u00e9lulas humanas sanas en cultivo. en 2004, nuestro grupo demostr\u00f3 que en ausencia del complejo iii, el complejo i se ensambla pero es inestable . Este fen\u00f3meno fue nuevamente observado por el grupo del dr. Carlos moraes, en l\u00edneas celulares de rat\u00f3n carentes de complejo iv. Ambos trabajos sugieren que la inestabilidad del complejo i es una consecuencia de la ausencia f\u00edsica del complejo iii \u00f3 del complejo iv.  para nuestra sorpresa, la expresi\u00f3n de aox estabiliza el complejo i, en ausencia de complejo iii o complejo iv, en c\u00e9lulas de mam\u00edfero. En nuestra opini\u00f3n, hay dos posibles explicaciones a este hecho: primera, la existencia de una interacci\u00f3n f\u00edsica entre el complejo i y aox (similar a la que pudiera existir entre complejo i y iii); o segunda, que sea la oxidaci\u00f3n de la ubiquinona por aox la que permita la estabilidad y la correcta funci\u00f3n del complejo i.  la demostraci\u00f3n de una posible interacci\u00f3n entre complejo i y aox ha sido abordada usando distintas aproximaciones: detecci\u00f3n de aox en geles de blue native mediante western blot, immunoprecipitaci\u00f3n del complejo i a partir de mitocondrias digitonizadas e inmunodetecci\u00f3n. La \u00faltima t\u00e9cnica utilizada en colaboraci\u00f3n con el servicio de prote\u00f3mica del centro nacional de investigaciones cardiovasculares (cnic), ha sido el an\u00e1lisis masivo de todas las prote\u00ednas que migran en el complejo i estabilizado y el supercomplejo nuevo que se forma en la l\u00ednea celular cytbkoaox. Para ello se llev\u00f3 a cabo una cromatograf\u00eda l\u00edquida acoplada a un espectr\u00f3metro de masas, desafortunadamente no se encontr\u00f3 ning\u00fan p\u00e9ptido correspondiente a aox en ninguna de las dos bandas. Por tanto, la posible interacci\u00f3n f\u00edsica entre complejo i y aox, que en un principio parec\u00eda ser la explicaci\u00f3n m\u00e1s plausible, no ha podido ser demostrada. Estos resultados confieren a la segunda hip\u00f3tesis un mayor peso en nuestro modelo. la acumulaci\u00f3n de ubiquinona reducida puede aumentar el da\u00f1o oxidativo en la mitocondria. La producci\u00f3n de radicales libres de ox\u00edgeno (o2-) en las inmediaciones del complejo i puede desencadenar su inestabilidad y posterior degradaci\u00f3n. La expresi\u00f3n de aox al oxidar la ubiquinona, impide que esto se lleve a cabo, estabilizando el complejo. Por tanto, en condiciones de baja concentraci\u00f3n de ox\u00edgeno, la cantidad de o2 disponible para producir ros disminuir\u00e1, reduciendo as\u00ed el da\u00f1o oxidativo estabilizando el complejo i. Este trabajo muestra resultados preliminares de dicha hip\u00f3tesis, realizados en colaboraci\u00f3n con el grupo del dr. Antonio mart\u00ednez del hospital la princesa de Madrid. En condiciones de 1% de ox\u00edgeno, volvemos a tener el complejo i estable en ausencia de complejo iii, iv, sugiriendo que puede ser del da\u00f1o auto-oxidativo a nivel de complejo i el responsable de la inestabilidad del mismo, arrojando nuevos indicios sobre la dependencia entre los complejos del sistema oxphos.  los mutantes en complejo iii y iv, gracias a la expresi\u00f3n de aox, restauran la actividad del complejo i, pero el bombeo de protones mediante s\u00f3lo \u00e9ste complejo, no es suficiente para alcanzar una fuerza prot\u00f3n motriz que permita a las c\u00e9lulas vivir indefinidamente en un medio no fermentable, muriendo al cabo de 2-3 d\u00edas. Aqu\u00ed encontramos una diferencia con lo sucedido en los mutantes en complejo i, donde gracias a la expresi\u00f3n de ndi1 las c\u00e9lulas son capaces de vivir en dicho medio, debido a la recuperaci\u00f3n de la oxidaci\u00f3n del nadh dentro de la mitocondria y al bombeo de protones a trav\u00e9s de los complejos iii y iv. la deconstrucci\u00f3n total de la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial supone el principal reto biol\u00f3gico afrontado en este trabajo. Mediante la xenoexpresi\u00f3n de las enzimas alternativas ndi1 y aox en c\u00e9lulas de rat\u00f3n carentes de mtdna (\u00c2\u00bf\u00c2\u00ba), hemos sido capaces de separar el transporte de electrones del bombeo de protones (y por tanto de la s\u00edntesis de atp).  en este trabajo hemos podido recuperar el flujo de electrones en la membrana interna de la mitocondria y restaurar as\u00ed las actividades metab\u00f3licas que de \u00e9l dependen. Dicho trabajo, nos ha permitido demostrar que la oxidaci\u00f3n de la ubiquinona por aox es suficiente para recuperar la actividad de la succinato deshidrogenasa del ciclo de krebs, la lanzadera del glicerol 3-p, la eft del metabolismo de \u00e1cidos grasos y dihidroorotato deshidrogenasa en la s\u00edntesis de pirimidinas, convirtiendo a la c\u00e9lulas en prot\u00f3trofas para el piruvato y la uridina. La ventaja que confiere la expresi\u00f3n de ndi1 en las c\u00e9lulas \u00c2\u00bf\u00c2\u00bandi1\/aox se pone de manifiesto al tratar las c\u00e9lulas con un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa kinasa (dca, inhibidor del reciclaje del nad+ por la fermentaci\u00f3n l\u00e1ctica). De este modo la obtenci\u00f3n de nad+ dentro de la mitocondria, v\u00eda ndi1, es cr\u00edtica para la supervivencia celular.  tanto las c\u00e9lulas \u00c2\u00bf\u00c2\u00baaox como las \u00c2\u00bf\u00c2\u00bandi1\/aox respiran, aunque dicha respiraci\u00f3n es sustancialmente menor que la respiraci\u00f3n end\u00f3gena observada en una l\u00ednea celular control. Mediante la expresi\u00f3n de otras nadh alternativas como la nadh-q oxidoreductasa externa de saccharomyces cerevisiae, localizada en el espacio intermembrana, capaz de captar los electrones del nadh citos\u00f3lico cedi\u00e9ndolos a la ubiquinona, podr\u00edamos aumentar el flujo de electrones y como consecuencia la respiraci\u00f3n celular. Aunque las c\u00e9lulas \u00c2\u00bf\u00c2\u00bandi1\/aox han recuperado el transporte de electrones desde el nadh hasta el ox\u00edgeno, son incapaces de vivir en un medio no fermentable, debido a que no pueden ensamblar el complejo v ya que carecen de dos subunidades mitocondriales (atpasa6 y atpasa8) y adem\u00e1s dichas enzimas alternativas no bombean protones al espacio intermembrana. Se ha demostrado que es posible restaurar la mayor parte del estr\u00e9s metab\u00f3lico inducido en la c\u00e9lulas por da\u00f1o en el sistema oxphos, indicando que dicho estr\u00e9s se debe m\u00e1s a la alteraci\u00f3n producida por un desequilibrio en el flujo de \u00f3xido-reducci\u00f3n de la ubiquinona, que a la p\u00e9rdida de la capacidad de la s\u00edntesis de atp mitocondrial. el an\u00e1lisis completo de todos los elementos que forman el sistema oxphos, se llevar\u00e1 a cabo cuando podamos estudiar el bombeo de protones independiente del transporte de electrones y la recuperaci\u00f3n de la s\u00edntesis de atp en ausencia de cadena.<\/p>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Datos acad\u00e9micos de la tesis doctoral \u00ab<strong>Construcci\u00f3n y deconstrucci\u00f3n de la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial<\/strong>\u00ab<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>T\u00edtulo de la tesis:<\/strong>\u00a0 Construcci\u00f3n y deconstrucci\u00f3n de la cadena de transporte electr\u00f3nico mitocondrial <\/li>\n<li><strong>Autor:<\/strong>\u00a0 Ester Perales Clemente <\/li>\n<li><strong>Universidad:<\/strong>\u00a0 Zaragoza<\/li>\n<li><strong>Fecha de lectura de la tesis:<\/strong>\u00a0 03\/03\/2010<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<h3>Direcci\u00f3n y tribunal<\/h3>\n<ul>\n<li><strong>Director de la tesis<\/strong>\n<ul>\n<li>silva Fern\u00e1ndez<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li><strong>Tribunal<\/strong>\n<ul>\n<li>Presidente del tribunal: manuel Lopez perez <\/li>\n<li>Mar\u00eda Monsalve p\u00e9rez (vocal)<\/li>\n<li>Carlos Lopez otin (vocal)<\/li>\n<li>Juan  pedro Bola\u00f1os hernandez (vocal)<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ul>\n<p>&nbsp;<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Tesis doctoral de Ester Perales Clemente El sistema de fosforilaci\u00f3n oxidativa o sistema oxphos est\u00e1 formado por cinco complejos multiprot\u00e9icos 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